人smad3的shrna表达载体构建和鉴定论文

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1、人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定论文谢桥生雷小英王立锋孟艳玲王芳薛茜温伟红杨安钢【摘要】目的：构建人Smad3的shRNA表达载体，运用RNAi下调Smad3基因在肿瘤细胞系中的表达，观察对肿瘤细胞生长的影响.方法：化学合成针对人Smad3基因的dsRNA，瞬时转染入Hela细胞，检测RNA干扰效果，筛选有效干扰靶位点；设计并合成针对人Smad3基因的siRNA寡核苷酸链，经退火形成双链后克隆入质粒载体pSilencerTM3.1H1hygro，转染入Hela细胞.freelycinB筛选稳定单克

2、隆细胞株，对细胞株行RTPCR和3.1H1hygro由西京医院刘家云博士惠赠；大肠杆菌DH5α、宫颈癌细胞系Hela由本实验室保存；细胞培养试剂、TRIZOLReagentRTPCR试剂盒、hygromycinB，LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；牛血清白蛋白（BSA）、兔抗人antiSmad3多克隆抗体（sc8332，SantaCruz公司）；兔抗人antiActin多克隆抗体、HRP标记羊抗兔二抗（武汉博士德公司）；NC膜（Millipore公司）；BCA

3、法蛋白定量试剂盒、JResearch公司）；酶联免疫检测仪（Model500，BIORAD公司）.1.2方法1.2.1siRNA的设计根据RNA干扰靶位点的设计原则，从Smad3mRNA（NM_005902）的编码序列中寻找符合设计特征的靶位点，经BLAST软件进行同源分析证实为Smad3特异性序列后，选择其编码区第941～959位核苷酸为干扰靶位点，由上海吉玛公司合成其dsRNA序列，Smad3正义链：5′GCACAUAAUAACUUGGACCdTdT3′，反义链：5′CGUGUAUUAUUGAAC

4、CUGGdTdT3′.由公司提供的阴性对照dsRNA与人类基因无同源性，正义链：5′UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3′，反义链：5′AAGAGGCUUGCACAGUGCAdTdT3′.1.2.2shRNA表达质粒载体的构建按上述靶位点构建shRNA表达载体，根据pSilencerTM3.1H1hygro质粒载体的要求设计1对能编码shRNA的寡核苷酸链，正义链：5′GATCCGCACATAATAACTTGGACCTTCAAGAGAGGTCCAAGTTATTATGTGCTTTTT

5、TGGAAA3′，反义链：5′AGCTTTTCCAAAAAAGCACATAATAACTTGGACCTCTCTTGAAGGTCCAAGTTATTATGTGCG3′；序列两端包含BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点，交由上海生工合成.阴性对照质粒为公司提供的针对绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP)的干扰载体，正义链：5′GATCCGGTTATGTACAGGAACGCATTCAAGAGATGCGTTCCTGTACATAACCTTTTTTGGAAA3′，反义链：5′AG

6、CTTTTTCCAAAAAGGTTATGTACAGGAACGCATCTCTTGAATGCGTTCCTGTACATAACCG3′.取寡核苷酸链制备退火双链DNA，连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切的pSilencerTM3.1H1hygro载体，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素阳性琼脂板上长出菌落，挑取单个菌落送交北京奥科生物公司测序.1.2.3细胞转染及单克隆细胞株的筛选常规培养Hela细胞于含100mL/L胎牛血清的RMPI1640，50mL/LCO2中，瞬时转染前24h，接种细胞

7、于6孔板中（2×105/孔），按LipofectamineTM2000操作说明转染Hela细胞.稳定转染筛选单克隆细胞株时，于转染前24h接种细胞于6孔板中（5×105/孔），转染后细胞培养于含100mL/L胎牛血清的RMPI1640，50mL/LCO2，150mg/LhygromycinB中，2ycinB筛选压力下，经历3ad3的单克隆细胞株.1.2.4RTPCR检测基因mRNA表达水平在6孔板中，每孔加入TRIZOLReagent1mL提取细胞总RNA，操作按试剂说明书进行，经逆转录得到cDNA.用专

8、业软件设计引物，内参照βactin上游引物：5′TGCGCAGAAAACAAGATGAGATT3′；下游引物：5′TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3′.Smad2上游引物：5′TTCCGCCTCTGGATGACTA3′；下游引物：5′TTTCTACCGTGGCATTTCG3′.Smad3上游引物：5′CACGCAGAACGTCAACAC3′；下游引物：5′GTGA