靶向大鼠ctgf的shrna表达载体的构建和作用分析

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1、靶向大鼠CTGF的shRNA表达载体的构建和作用分析作者：郎明健，曾秋棠，郭敏，杨汉东，闵新文【摘要】　　目的:构建并筛选靶向大鼠结缔组织生长因子（CTGF）的shRNA表达载体.方法:根据大鼠CTGFmRNA序列设计并构建4个靶向大鼠CTGF基因的shRNA干扰质粒；然后以脂质体转染试剂将目的质粒转染至大鼠心肌成纤维细胞，流式细胞技术分选出成功转染的阳性细胞.通过RTPCR和:ToconstructandscreenoutthepotentshorthairpinRNA(shRNA)expressingplasmidsidstargetingtoratCT

2、GFmRNA(AccessionNo:NM_022266)RNA.Therebinantplasmidseassayandnucleotidesequenceanalysis.Thentheplasmidsine2000reagent,andthepositivecellsRNAandprotEinexpressionsofCTGFid.RESULTS:The4rebinantplasmidvectorsexpressingCTGFtargetingshRNAeassayandsequenceanalysis.FortyEIghthoursposttrans

3、fection,themRNAandproteinexpressionsofCTGFdecreasedin3experimentalgroupsparedidandlipofectamine2000group.CONCLUSION:FourrebinantplasmidstargetingtoratCTGFaresuccessfullyconstructed,and3potentrebinantplasmidsarescreenedout.ThislaysafoundationforfurtherresearchesofRNAinterferenceoncard

4、iacfibrosisinvivoandinvitro.【Keyid;transfect;cardiacfibrosis　　0引言结缔组织生长因子（connectivetissuegroRNA水平的干扰技术，具有相对简单、抑制作用更为完全、特异性高等特点，在高通量研究基因功能、信号转导通路及进行靶向基因静默治疗等方面广泛应用.本研究通过构建并筛选CTGF靶向特异性的shRNA（shorthairpinRNA）真核表达载体，为今后通过RNAi技术抑制CTGF表达、从基因与蛋白质水平探索CTGF在促心肌纤维化的作用打下基础.1材料和方法1.1材料真核表达载体pGen

5、esil1质粒和感受态大肠杆菌DH5α购自武汉晶赛生物工程技术有限公司;限制性核酸内切酶BamHI,HindⅢ,SalI,PstI和T4多聚核苷酸激酶及其缓冲液均购自宝生物工程大连有限公司;T4DNA连接酶及缓冲液购自Neine2000购于Invitrogen;山羊抗大鼠CTGF多克隆抗体购自SantaCruz;HRP标记的兔抗山羊二抗及ECL试剂盒购于Pierce公司.1.2方法1.2.1CTGF靶向性shRNA序列的设计与合成CTGF靶向性shRNA干扰序列的设计合成参见2结果2.1选定的靶序列及针对每条靶序列设计的双链shRNA靶序列结构模式：BamHI

6、+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SalI+HindIIICTGF1:AAGGGTCTCTTCTGCGACTTC;CTGF1A:5′GATCCGGGTCTCTTCTGCGACTTCTTCAAGACGGAAGTCGCAGAAGAGACCCTTTTTTGTCGACA3′;CTGF1B:3′GCCCAGAGAAGACGCTGAAGAAGTTCTGCCTTCAGCGTCTTCTCTGGGAAAAAACAGCTGTTCGA5′;CTGF2:AAAGATGGTGCACCCTGTGTC;CTGF2A:5′GATCCAGATGGTGCACCC

7、TGTGTCTTCAAGACGGACACAGGGTGCACCATCTTTTTTTGTCGACA3′;CTGF2B:3′GTCTACCACGTGGGACACAGAAGTTCTGCCTGTGTCCCACGTGGTAGAAAAAAACAGCTGTTCGA5′;CTGF3:GAGTCCTTCCAAAGCAGTT;CTGF3A:5′GATCCGAGTCCTTCCAAAGCAGTTCTATGGACAAACTGCTTTGGAAGGACTCTTTTTTGTCGACA3′;CTGF3B:3′GCTCAGGAAGGTTTCGTCAAGATACCTGTTTGACGAA

8、ACCTT