双基因共表达的tet-on载体的构建和检测

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1、摘要Tet．on系统是一种基于四环素操纵子(tetracyclineoperaon)的可调控基因表达系统，当四环素(tetracycline，Tet)衍生物强力霉素(doxcycline，Dox)不存在时，反式四环素转录活化因子(reversetetracycline．controlledtransactivator,rtTA)不能识别四环素操纵基因(TetOperator,TetO)，目的基因不表达；当有Dox存在时，rtTA才可与TetO结合启动基因的转录。本研究主要利用FMDV来源的2A序列和EMCV来源

2、的IRES序列两种共表达元件，对Tet-on表达系统进行改造，构建了两个单质粒单启动子的双报告基因Tet-on表达载体，利用红色荧光蛋白dsredI和增强型绿色荧光蛋白egfp两种报告基因进行诱导倍数的定量检测。根据Real．timePCR定量结果和镜检结果，经过改造以后的两个表达系统不加入诱导剂时的本底水平均比原来的pTREAutoR3更低，并且得到较为良好的诱导倍数；两种不同改造策略得到的共表达Tet．on载体中，pTREDsRedl．IRES．EGFPAutoR3比pTREDsRedl一2A-EGFPAu

3、toR，本底更低，诱导效率更高。通过改造得到的这种单质粒单启动子的双报告基因Tet．on表达载体既能够实现四环素调控又能借助共表达方式以报告基因EGFP的荧光强度作为上游基因表达量的直观检测手段，将来把上游报告基因dsredl替换成功能基因时，就既能由强力霉素调控外源基因表达，又能实现功能基因与报告基因共表达，且同时受Tet．on系统调控，这样将既能通过加入诱导剂的时间和剂量来控制功能基因的表达式时问和表达量，又能方便地通过对报告基因的直观检测来间接地对功能基因进行定量，保证基因表达在动物胚胎发育阶段上的特异性

4、，也可以避免一些有毒性或致死作用的外源基因持续性表达对动物胚胎发育的影响；这将是对Tet．on系统研究的一个补充和创新，并且能大大简便tet．on系统的操作和功能基因表达的定量。关键词：Tet．on，2A，IRES，双基因共表达福建师范人学郊若男硕十学位论文II}AbstractlIlllIIIIIIlllllllUl＼1807148Tet-onsystemisallinduciblegeneexpressionsystembasedontetracyclineoperaon．Whendoxycycline(D

5、ox)，tetracyclinederivatives，isabsentthereversetetracycline—controlledtransactivator(rtTA)isnotabletorecognizetetracyclineoperator(TetO)，thetargetgenecann’tbeexpressed；onlywhenthereisDox，rtTAisabletorecognizeandcombinewithTetO，thenpromotethetranscriptionoftar

6、getgene．ThisresearchismainlyaboutthetransformationofrecentTet—onsystem，makinguseof2AfragmentfromFMDVandIRESfromEMCV．Twosingle-plasmid，single-promoteranddual．reporterTet—onvectorwereconstructed，dsredlandegfpwereusedasreporterforquantitativedetection．According

7、toReal—timePCRandmicroscopyresults，whenDoxisabsent，thebackgroundexpressionlevelofbothtwomodifiedTet-onsystemsislowerthanthatintheoriginalsystempTREAutoR3，theinductionmultipleisalsobetter．Amongthetwomodifiedsystems，thebackgroundlevelofpTREDsRedl-IRES-EGFPAuto

8、R3islowerandtheinductionmultipleishigher．ThesetwoexpressionsystemsnotonlyCancontroltheexpressionoftargetgeneviaDox，butalsodetectitsexpressionlevelviathefluorescenceintensityofEGFP．Iftheupstreamg