增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因共表达载体的构建和表达.doc

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1、增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因共表达载体的构建和表达郑敏明，周希瑗，王丽萍（400010重庆，重庆医科大学附属第二医院眼科，眼科学重庆市市级重点实验室）[摘要]目的构建增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达。方法用PCR技术对cDNA-Rb质粒中的目的基因片段进行扩增，使用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，切胶回收DNA片段。将其连接入pEGFP-C1，构建pEGFP-C1/Rb94真核表达载体并再进行酶切鉴定。将重组质粒用脂质体转染法转染至人视网膜母细胞瘤细胞（HXO-Rb44）中，荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达，Wester

2、nblot检测Rb蛋白的表达情况，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果重组克隆载体内的目的片段序列与Rb94基因序列完全一致。pEGFP-C1/Rb94酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现。Westernblot检测结果表明Rb94基因得到了有效表达。流式细胞仪检测结果显示，含Rb94基因的细胞凋亡率(21.17±0.45)%也明显高于其他组。结论成功构建EGFP和Rb94真核共表达载体，并可在真核细胞中有效表达，Rb94对视网膜母细胞瘤细胞有明显抑制生长作用。[关键词]Rb94基因；真核表达载体；人视网膜母细胞瘤细胞Constructiona

3、ndexpressionofenhancedgreenfluorescentproteinandRb94co-expressionvectorZhengMinming,ZhouXiyuan,WangLiping(ChongqingKeyLaboratoryofOphthalmology;DepartmentofOphthalmology,theSecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity)Abstract：ObjectiveToconstructatypeofenhancementofEGFPandRb94co-e

4、xpressionvector,meanwhile,wecandetectitsexpressioninculturedeukaryocyte.MethodsBymeansofPCR,wecouldgettheamplificationofRb94genefragmentwithcDNA-Rbplasmid.TheRb94genefragmentwasdigestedwithBamHIandSalI,sequentantly,whatinsertedintopEGFP-C1thatwascutwithBamHⅠandSalⅠ.TherecombinantpEGFP-C1/

5、Rb94wasidentifiedwithrestrictionanalysis.TheexpressionplasmidpEGFP-C1/Rb94wastransfectedintoHXO-Rb44cellmediatedbyliposomereagent,simultaneously,wecouldmakeaobservationoftheexpressionofEGFPincellbyfluorescencemicroscopy,moreover,RbproteinwasdetectedthroughWesternblotting.Theapoptosisrateo

6、fHXO-Rb44cellswasdetectedbyflowcytometer.ResultThesequenceoftheclonedDNAfragmentisfullyconsistentwiththesequenceofRb94gene.TheRb94genewasinsertedintoeukaryoticexpressionvectorpEGFP-C1correctly.TherecombinantexpressionplasmidwassuccessfullytransferredintoHXO-Rb44observedbyfluorescentmicros

7、copyandeffectiveexpressionofRbproteinwasalsotestifiedbyWesternblotting.TheapoptosisrateofcellswithinRb94genewashigherthanothergroups.ConclusionTherecombinanteukaryoticco-expressionvectorofEGFPandRb94wassuccessfullyconstructedandeffectivelyexpressedinHXO-Rb44.Rb94has