增强型绿色荧光蛋白（egfp）基因真核表达载体构建和表达

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1、四川犬攀顿士学位论文檬浩杰摘要目的：为研究蠓强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)罄因在活纲溉中{搴为报告基因帮筛选标记酶可行稳，特构建其真核表达载体pCDNA3．1(+)-EGFP，并将它转染至Hela缨胞和大鼠骨髓闻充质于细胞(mesenchymalstemcell，MSC)中，躐察箕在这两释细胞中酌表达情况。方法：以BamHI和Not1双酶切分别从真核表达载体pCDNA3．1(+)_荦班EGFP载体pEGFP一1中切敬线性化pCDNA3。l(+)载体和晷鲍EGFP基闲片段，然磁

2、将两者连接起来，献两获得重组质糍pCDNA3．1(+)一EGFP。并分别以BamHI单酶切和BamHI、NotI双酶切进行鉴寇。以腮质体转染试剂LipofectAMINE2000分别将构建姆约重组质靛转染歪培养豹Hela细胞和大鬣雷髓闻充艨干细胞中，分别经G418筛选两周和四周厝获得EGFP阳性克隆，进行细胞爬片质放置在荧光晟微镜下鼹察。缝纂：成功构建了含EGFP基困片段的凑核表运载体pCDNA3．1(+)一EGFP，并顺利转染至Hela细胞和大鼠骨髓间充质干细胞中，EGFP疆性克隆在荧光照微镜下均嫩绿色。绪论：EGFP基因能以真核寝达

3、载体pCDNA3．1(+)一EGFP的形式在Hela细胞和大鼠骨髓间充质干细胞中成功表达，并发出绿色荧光，霹鼠可以直接戮用荧光显徽镜辩活缨魁遴行捡溅，爨鼹EGFP基蔽是一种庭好豹活细胞报告基戮鞫筛选标避。关键词；增强烈绿色荧光徵白(EGFP)蕊因：真核表达载体；转染；Hela缨戆；大簸鸯髓淘充屡于缎照四川大学醐士学位论文撩浩杰AbstractObjective：Tostudythepossibilityofenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)geneasinformationalgeneandsel

4、ectmarkinlivingcell。constructtheeukaryoticexpressionvectorpCDNA3，1(+)-EGFPforenhancedgreenfluorescentproteingene，andtransfertheeukaryoticexpressionvectortoHelaeellandrattnalTowmesenchymalstemcell，thenobservetheexpressionofenhancedgreenfluorescentproteingeneinthesetwotype

5、sofcells．Methods：DigesttheeukaryoticexpressionvectorpCDNA3，1(+)-EGFPandenhancedgreenfluorescentproteinvectorpEGFP一1withtwotypesofrestrictivelynucleicacidinscribedenzyme：BamHtandNot{，obtainlinearizationpCDNA3．1(+)vectorandobjectiveEGFPgenesegment，andjointhemtogetheLconseq

6、uentlygainrecombinedplasmapCDNA3，1(+)一EGFP,thenidentifyitwithBamHlsingleenzymedigestionandBamH，I、NotIdoubleenzymedigestion，TransferrecombinedplasmapCDNA3．1(+)-EGFPtocultivatedHellcellandratmarrowmesenchymalstemcellbylipidtransferringreagentLipofectAMINE2000，afterselectin

7、gthemfortwoweeks(forHellcell)andfourweeks(forratmarrowmesenchymalstemcell)byG418reagent，obtainpositivecloneofenhancedgreenfluorescentprotein，observethemwithfluorescentmicroscopeaftercellcreepparcel．Results：ConstructtheeukaryoticexpressionvectorPCDNA3．1(十)一EGFPforenhanced

8、greenfluorescentproteingenesuccessfully,and2璺纠盔兰鲤杰兰垡堡塞熊煎查transferittoHelacellandralmarrowmesenehymalste