利用大肠杆菌表达增强型绿色荧光蛋白（egfp）

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1、分子生物学实验设计池朋亮2013141241180，杜吉阳2013141241160利用大肠杆菌表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）池朋亮，杜吉阳摘要绿色荧光蛋白是近年来在生物化学和细胞生物学中应用最广泛的标记性蛋白质之一。本实验设计计划通过基因工程的方法，利用大肠杆菌表达系统表达增强型绿色荧光蛋白，首先pEGFP-N3和pET-28a(+)质粒从含有相应质粒的的E.coli中提取出来，然后利用NotI和BamHI双酶切法将两种质粒切开再利用T4连接酶构建pET-28a-EGFP质粒DNA，将重组质粒转入E.co

2、liDH5α中，最后通过IPTG诱导E.coli中的EGFP基因表达，在紫外线的照射下发出绿色荧光。关键词：E.coli；EGFP；基因工程；实验设计。目录1引言…………………………………………………………………………………………..……21.1绿色荧光蛋白GFP与pEGFP-N3质粒……………………………………………….….……21.2大肠杆菌表达系统…………………………………………………………………..….………31.3实验流程……………………………………………………………………………..….………42目的

3、基因pEGFP-N3质粒和表达载体pET-28a质粒DNA的获取及检测…………........….…42.1实验原理………………………………………………………………………………...………52.2实验目的…………………………………………………………………………….…..………52.3实验材料……………………………………………………………………….………..………52.4实验方法…………………………………………………………………………….……..……52.5琼脂糖凝胶电泳检测………………………………………….……

4、…………………..………62.6实验结果预测…………………………………………………………………………………...63pET-28a-EGFP重组质粒的构建………………………………………………………….….…...73.1实验原理……………………………………………………………………..…...….……….…73.2实验目的……………………………………………………………………………...…………83.3实验材料……………………………………………………………………………...…………83.4实验方法………………………

5、……………………………………………………...…………83.5实验结果预测…………………………………………………………………….…….….……94用CaCl2制备感受态大肠杆菌和pET-28a-EGFP重组质粒的转化及筛选……………….……94.1实验原理………………………………………………………………………………...………94.2实验目的……………………………………………………………………………….………104.3实验材料……………………………………………………………………………….………104.4实验步骤

6、……………………………………………………………………………….………114.5实验结果预测………………………………………………………………………….………115用IPTG诱导表达转入E.coli中pET-28a-EGFP重组基因……………………………....……125.1实验原理………………………………………………………………………….……………125.2实验目的…………………………………………………………………………….…………125.3实验用品…………………………………………………………………………….……

7、……125.4实验步骤…………………………………………………………………………….…………125.5结果预测与讨论………………………………………………………………….……………137参考文献…………………………………………………………………………………………131分子生物学实验设计池朋亮2013141241180，杜吉阳20131412411601、引言1.1、绿色荧光蛋白GFP与pEGFP-N3质粒绿色荧光蛋白（GreenfluorescentproteinGFP，如图1)来源于海洋生物水母，在蓝光或紫光下可

8、发出荧光，近年来在生物化学和细胞生物学中成为应用最广泛的标记性蛋白质之一，目前应用最多的是GFP的突变体——增强型绿的荧光蛋白（EGFP）（64位苯丙→亮），发射出的荧光强度比GFP大6倍以上，因此，比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和运转等。EGFP与其它标记物相比具有明显的优点：1、分子量小，在细菌及真核细胞中表达无明显毒性作用。2、