正文描述:《增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达【毕业设计】》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、本科毕业设计(20__届)增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达18目录摘要1ABSTRACT2引言31材料与方法51.1材料51.1.1菌株与质粒51.1.2工具酶及试剂51.1.3培养基51.2方法51.2.1引物设计及合成51.2.2目的基因EGFP编码序列的克隆51.2.3PCR扩增产物的鉴定61.2.4目的片段回收61.2.5连接61.2.6大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备61.2.7转化71.2.8阳性克隆的筛选与鉴定71.2.9pMD19-EGFP质粒的抽提81.2.10重组质粒pET-28a-EGFP的构建及鉴定81.2.11转EGFP基因大肠杆菌的获得及原核表
2、达条件的研究102结果与分析112.1目的基因EGFP编码片段的克隆112.2pMD19-EGFP质粒的构建和鉴定112.3重组质粒pET-28a-EGFP的构建和鉴定122.4转EGFP基因的大肠杆菌原核表达条件的研究133讨论144结论15致谢16参考文献1718摘要:绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因是在细胞内稳定表达,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因。增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)是GFP的一个突变体,发出的荧光强
3、度要比GFP大六倍以上,更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体定位和转运等。本实验旨在构建以EGFP为标记的原核表达载体,观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况,探索其作为报告基因在以后研究中应用的可能性。根据已知的EGFP序列,设计一对引物FEGFP和REGFP,分别含有NdeI和EcoRI酶切位点,通过PCR从pFGC-EGFP质粒中克隆EGFP编码序列,并将其与pMD19T-Vector连接,以此构建pMD19-EGFP。将其双酶切后与pET-28a连接,得到重组质粒pET-28a-EGFP。转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,在诱导的不
4、同时间收集菌体沉淀,并置于长波紫外线下照射,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量。经IPTG诱导后,细菌培养物在紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光。本实验成功构建了原核表达载体pET-28a-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础。关键词:增强型绿色荧光蛋白;重组质粒;大肠杆菌;原核表达18Abstract:Thegreenfluorescentprotein(GFP)geneisanewreportergenewhichcanbeexpressedinlivingcells,underexcitationoflongUVlightorbluelight,gree
5、nfluorescencecanbeemittedwithoutotherexternalsubstrate.Theenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)isamutantofGFP,whichcanemitsixtimehigherfluorescence.Asareportergene,itismoresuitableforstudyinggeneexpressionandregulation,celldifferentiationandproteinlocalizationandtransferinlivingorganisms.Thep
6、urposeofthisstudywastoconstructtheEGFP-labelledprokaryoticexpressionvectoranddetecttheexpressionofEGFPinEscherichiacoli.AccordingtotheopenreadingframeofknownEGFPgene,apairofprimers,whichcontainstworestrictionenzymesitesNdeⅠandEcoRⅠrespectively,wasdesigned.AfragmentofEGFPgenewasobtainedbyPCRam
7、plificationfrompFGC-EGFPplasimd.ThenthePCRproductswerelinkedtopMD19T-VectorsoastoconstructpMD19-EGFP.ItwasdigestedandligatedwithpET-28a,toconstructtherecombinantplasmidpET-28a-EGFP.ThepET-28a-EGFPwastransformedintoE.coilBL21.InducedbyIPTG,the
显示全部收起
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。