增强型绿色荧光蛋白

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1、增强型绿色荧光蛋白：伍徐娴，何志旭，沈祥春，周中军【摘要】目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhancedgreenfluorescentprotein，pEGFPC1）标记骨髓间充质干细胞（marroesenchymalstemcells,MMSCs），以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法:在体外分离培养大鼠MMSCs，流式细胞仪检测细胞表型，以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因，荧光显微镜观察基因表达。结果:pEGFPC1在基因转染24h后开始表达，48～72h达高峰，12～14d后有较多的表达。结

2、论:由脂质体介导的质粒pEGFPC1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。【关键词】骨髓间充质干细胞；增强型绿色荧光蛋白；基因转染　　［Abstract］Objective:Todevelopanappropriatetracingmethodfortransplantedmarroesenchymalstemcells(MMSCs)invivo.Methods:MMSCsofratsbonemarroembrane'smarkseter.CulturedcellsidofpEGFPC1medi

3、atedbylipofectamine,andtransientexpressionicroscopy.Results:TheexpressionofpEGFPC1ainedstrongexpressfor12～14moredays.Conclusion:LipofectaminemediatedtransfectioncanmakepEGFPC1expressedinMMSCssafelyandeffectively,ethodforstemcelltracking.　　［Keyarroesenchymalstemcel

4、ls;enhancedgreenfluorescentprotein;genetransfec-tion　　骨髓间充质干细胞（marroesenchymalstemcells,MMSCs）成为近年来干细胞研究的热点，其不仅本身可发挥治疗作用，同时也可作为外源基因的载体和表达场所[1]，是基因治疗理想的种子细胞[2]。2007年3月～2008年3月通过对大鼠MMSCs体外增殖培养，应用增强型绿色荧光蛋白C1（pEGFPC1）基因表达的质粒转染MMSCs并筛选培养，旨在建立一个较好的基因标记条件，为MMSCs应用于后续基因治疗

5、的可行性奠定基础，为MMSCs的生物学行为提供新的示踪方法。　　1材料与方法　　1.1动物、试剂和仪器　　清洁级近交系SD大鼠（贵阳医学院动物实验中心提供）6只，雄性，体重(110±10)g，健康。质粒pEGFPC1由香港大学周中军教授惠赠，菌株E·ColiDH5α由贵阳医学院分子生物学实验室保存并提供，LDMEM购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，离心柱型质粒小提中量试剂盒购自TIANGEN公司，HindⅢ限制性内切酶购自TakaRa公司，脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公

6、司，G-418购自Solarbio公司，荧光显微镜购自Olympus公司。　　1.2大鼠MMSCs的体外分离、纯化、增殖培养及鉴定　　取雄性SD大鼠颈椎脱臼法处死，分离股骨及胫骨，收集骨髓腔内细胞，接种于含10％胎牛血清的L-DMEM培养瓶中，37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。第3天后半量换液，以后每3d更换新鲜完全培养液，待细胞接近90％铺满瓶底时，倾去培养液，用0.25％胰蛋白酶常温下消化并传代，用新鲜完全培养基重悬细胞，按照1∶2接种于培养瓶中继续增殖培养。每日定时于倒置相差显微镜下观察，记录细胞形态的变化和增殖

7、情况；取传代培养至第5代的MMSCs制成单细胞悬液，应用流式细胞仪进行细胞膜表面分子CD29、CD34、CD45及CD71的水平检测分析。　　1.3质粒的扩增、提取及鉴定　　取大肠杆菌DH5α用氯化钙法制备感受态细菌，将质粒pEGFPC1转化感受态细菌，37℃培养24h，挑取单菌落接种到含卡那霉素（100mg/L）的LB液体培养基中，37℃震荡（220r/min）培养过夜，取菌液1.0ml，按照离心柱型质粒小提中量试剂盒说明书用碱裂解法提取质粒DNA。紫外分光光度计测定质粒DNA浓度，取1μg质粒DNA用HindⅢ酶切，1%

8、琼脂糖电泳鉴定酶切结果。　　1.4质粒pEGFPC1转染大鼠MMSCs　　应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导pEGFPC1转染MMSCs，以400mg/L的G418进行筛选，荧光显微镜下观察细胞并拍照。为提高转染率，质粒DNA∶Lipofecta