增强型绿色荧光蛋白标记的hela细胞株的建立

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1、增强型绿色荧光蛋白标记的Hela细胞株的建立：杨军，陈晓黎，苏宝山，王一理，司履生【摘要】　　目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFPC1真核表达质粒，采用Qiagentip500进行pEGFPC1真核表达质粒DNA的提取和纯化；cellfectin转染Hela细胞，G418筛选，有限稀释法单克隆培养，荧光显微镜进行荧光检测EGFP的表达，采用激光共聚焦显微镜观测器检测荧光特性。结果PCR和DNA测序证实pEGFP质粒结构正确；在倒置荧光显微镜下，转染24h后，部分Hela细胞可见绿色荧光，转染72h时，大约80%Hela细胞内均可见

2、绿色荧光。加入含G418的选择性培养基进行选择性培养，选择荧光较强的Hela细胞经有限稀释，持续筛选及克隆化培养，获得稳定表达绿色荧光的Hela细胞克隆，扩大培养并传至10代以上，将此细胞株命名为HelaEGFP。激光共聚焦显微镜观察发现：在蓝光(-395nm)激发时，HelaEGFP细胞绿色荧光激发波长为395nm，最大发射峰为509nm。结论HelaEGFP细胞株具备稳定表达EGFP的能力，为实时可视化进行宫颈癌侵袭转移机制的研究奠定了基础。【关键词】增强型绿色荧光蛋白；宫颈癌；Hela细胞　　ABSTRACT:ObjectiveToconstructanovelenhancedgr

3、eenfluorescentprotein(EGFP)taggedHelacellsubline.MethodsEGFPgenefragmentplifiedfrompEGFPC1vectorandconfirmedbyPCRandgenesequencing.pEGFPC1vectorDNAediumcontaininggeicin(G418)andlimitingdilutionin96edcultureplates.1640、胎牛血清、OPTIMEM无血清培养基、Cellfectin转染试剂盒购于Invitrogen；HEPES购于Gibco公司；琼脂粉、胰酶、台盼蓝、DMSO

4、、G418购于Sigma公司；Qiagentip500质粒提取试剂盒购于Qiagen公司。二氧化碳培养箱(USA)；倒置荧光显微镜(Olympus,Japan)。　　1.2pEGFP质粒的PCR鉴定　　取-70℃冻存含pEGFP质粒的菌株，划线接种于含50mg/LAmp(氨苄青霉素)的LB琼脂培养皿上，37℃倒置培养过夜或16-20h。挑取单菌落于5mL含50mg/LAmp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。采用碱裂解小量质粒提取法提取质粒DNA，溶于20μL去离子水中(参见分子克隆)。取2μL质粒DNA，在10g/L(1%)TBE琼脂糖凝胶电泳分析，80V/40mA电泳，紫外光下观察，

5、4℃保存备用。按照pEGFP质粒设计引物，P1：5′CATGCCATGGGAATGGTGAGCAAGGGCGAG3′；P2：5′GCGCGTCGACGGCTTGTACAGCTCGTC3′。采用PCR方法，以pEGFP质粒为模板，以P1、P2引物扩增EGFP基因片段。用PCRBeads进行扩增反应，每个Beads中加双蒸水20μL，上、下游引物各2μL、模板1μL。PCR扩增体系为25μL，混匀各成分，矿物油覆盖液面。PCR反应条件：94℃变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环，72℃10min。将PCR产物行10g/L(1%)TBE琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观

6、察。　　1.3pEGFP真核表达质粒的大量提取与纯化　　取经鉴定的含pEGFP质粒的菌株于37℃快速振荡培养过夜，转接种到500mL含50mg/LAmp的LB培养液中，37℃快速振荡培养8-10h，测A值至0.4-0.6，加入氯霉素使终浓度为170g/L，继续振荡培养6h。4℃，4000r/min，离心10min，弃上清，收集细菌沉淀物。用Qiagentip500进行质粒提取和纯化(具体步骤参见操作手册)。行10g/LTBE琼脂糖凝胶电泳分析，80V/40mA电泳，紫外光下观察，4℃保存备用。紫外分光光度计测定质粒的A260和A280，进行DNA定量，终浓度调节至100g/L。　　1.4Hel

7、a细胞的培养及pEGFP真核表达质粒的转染　　用RPM1640完全培养基并辅以100mL/L胎牛血清、青霉素、链霉素各100mg/L，在37℃、50mL/LCO2条件下培养Hela细胞。转染前2周进行G418最小致死浓度试验。转染前18h，将处于对数增长期的Hela细胞胰酶消化传代。将Hela细胞均按每孔约2×105细胞接种于6孔培养板中，至细胞密度大约为60%时，弃去细胞培养液，用无血清培养基洗