实验绿色荧光蛋白

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1、生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：2011506066班级：11级生技02班母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋0。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP由3个外敁子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.OkMr,其蛋白性质十分稳定，能耐受60°C处理。1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420run，宽240™，由11个围绕中心a螺旋的反平行P折叠组成，荧光基团的形成就是从

2、这个螺旋丌始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色I才I则位于大空腔内。发色闭是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.一.实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基木技术。二.实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目

3、的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。本实验根据绿色荧光蛋白(GFP)的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出來。再利用双酶切切开表达载体pET23b和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3)，在IPTG的诱导下，使GFP基因表达三.实验材料及仪器1、实验材料:含有GFP的质粒；DNAMarker；DH5a；BL21；2、仪器：

4、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒糈灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。四.实验内容4.1质粒的提取、酶切及电泳鉴定：1)实验试剂:LB培养基;溶液I;Tris-HCl(pH=8)；溶液II;溶液III;酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸染色剂;1%的琼脂糖凝胶；Xhol(10U/P1)；NdeI(lOU/u1)；T,DNA1isase。2)实验步骤:质粒的

5、提取与鉴定(1)在含有质粒的DH5a平板菌落上挑取单菌落，接种于20ml含有100M1/mlApm的LB液体培养基屮，37°C、200rpm振荡培养过夜。(2)分装菌液到1.5ml离心管中,冰浴2min。4°C、12000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。再用同样方法收集一次菌体。(3)将细菌沉淀重悬于100ul预冷的溶液I中，涡旋剧烈振荡，混匀，冰浴lOmirio(4)加200Pl新鲜配制的溶液II，盖紧管U,轻柔快速颠倒离心管5次，充分混匀，冰浴5min。(5)加入150u1预冷的溶液III,盖紧管U,轻柔快速颠倒离

6、心管数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物屮分散均匀，见0色絮状沉淀，可在冰上放置10mino4°C.12000rpm离心lOmin。(6)加等体积的酚/氯仿(1:1)，震荡混合有机相和水相，冰浴3min。4°C、12000rpm离心lOmin,吸取上层水和转移到另一新离心管中。(7)加等体积的氯仿:异戊醇(24:1),振荡混合有机相和水相，4°C、12000rpm离心lOmin,吸取上层水和转移到另一新离心管中。(8)加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20°C沉淀DNA10_20min。4°C,12000rpm离心lOmin,弃

7、上清，留沉淀(管底有少量白色沉淀)。(9)分2次加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min,抽吸去除所有上清，放置室温干燥，让酒精挥发。(10)加30u1TE(内含浓度50ug/ml的RNaseA)溶解DNA,37°C放置30min,消化RXA。-20°C保存备用。(11)制1%的琼脂糖凝胶：加25mlXTAE缓冲液于三角瓶。称取0.25g琼脂糖加到三角瓶中，与微波炉加热至完全溶化。冷却至60°C左右，加1y1的GoldView溶液，摇勾。轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30min以上。

8、轻轻拔掉梳子，将凝胶放入电泳梢中，加入电泳缓冲液(TAE)中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约lmm。(12)点样：取5ul质粒DNA及2ul加样缓冲液混合上样，80—100v约电泳20一30mirio质粒DNA的酶切(1)酶切：按如下双酶切体系(20ul)混合反应物III质粒5u13u1Xho