绿色荧光蛋白的克隆实验汇报..ppt

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1、绿色荧光蛋白的克隆实验汇报组员：洪旭伟唐开强胡巍然蔡毅绿色荧光蛋白简介绿色荧光蛋白（GFP）是一种存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的发光蛋白，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。绿色荧光蛋白简介绿色荧光蛋白相对荧光素/荧光素酶的优点：1、发光机理简单2、光毒性非常弱它的这一些性质为生物学研究提供了很好的标记分子，可以在黑暗的显微镜视场中观察到细胞中的细胞器等结构，而且还能够标记活细胞，使得活细胞中结构的观察成为可能。绿色荧光蛋白简介他们因为在研究绿色荧光蛋白方面所作的贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖下村修马丁·沙尔菲钱永健实验目的掌握绿色荧

2、光蛋白的基因克隆的一般步骤，加深对基因克隆的认识，如：在提高实验技能的同时，还要注重提高自身的实验素养以及培养严谨的科学研究态度掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握紫外吸收测定DNA的方法了解质粒酶切鉴定原理掌握琼脂糖凝胶电泳技术实验材料大肠杆菌DH5a菌株pMD18-T载体易瑞质粒小量提取试剂盒TakaraEcoRI限制性内切酶TakaraHindIII限制性内切酶Takara10×M酶切缓冲液BioWest电泳琼脂糖干粉0.5×TBE核酸电泳缓冲液EB核酸荧光染料Takara6×电泳上样缓冲液实验仪器恒温摇床台式高速离心机PCR仪水平电泳槽电泳仪水浴锅1、含目的基因质粒的提取2、

3、PCR扩增目的基因3、构建重组DNA4、重组DNA的转化5、重组DNA的筛选6、重组DNA的鉴定实验步骤1、含目的基因质粒DNA的提取实验原理：在PH为12.6的碱性环境下，利用细菌染色体完全变性而质粒DNA为完全分离的性质，再将溶液PH调至中性，质粒DNA恢复原状，细菌线性DNA变为沉淀而除去1、含目的基因质粒DNA的提取实验步骤：1.5mL菌液12000rpm1min菌体沉淀溶液S1250μl剧烈震荡裂解液S2250μl颠倒混匀4-6次中和液S3350μl温和地颠倒混匀6-8次12，000rpm10min室温静置3~5min至出现白色絮状沉淀取600μl上清至吸附柱管12，

4、000rpm30s12，000rpm30s洗涤液W600μl12，000rpm30s10，000rpm2min取吸附柱至另一新EP管洗脱液50μl56℃预热12，000rpm1min室温静置1min弃滤液空柱收集洗脱液备用洗涤液W600μl弃滤液弃滤液2.悬浮细胞1.收集细胞3.裂解细胞4.中和6.洗柱7.洗脱5.过柱分离1、含目的基因质粒DNA的提取电泳结果：结果分析：2、PCR扩增目的基因实验原理：PCR由变性—退火—延伸这三个基本反应构成：①模板DNA的变性，即加热使DNA双链解离为单链；②退火降温后，引物与模板DNA单链配对结合；③DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚

5、合酶的作用下，合成一条新的与模板DNA链互补的复制链。经过2～3小时的扩增，目的基因就能扩增几百万倍2、PCR扩增目的基因实验步骤：①94℃预变性5分钟后开始以下循环②94℃30秒56℃30秒30循环72℃1分钟③72℃7分钟④4℃保温实验过程约1小时50分钟2、PCR扩增目的基因电泳结果：结果分析：3、构建重组DNA实验原理：利用pMD18-TVector这个高效克隆PCR产物的专用载体，在连接液中短时间对目的基因与载体进行连接3、构建重组DNA实验步骤：①在微量离心管中配制下列DNA溶液：pMDTM18-TVector0.5μlInsertDNA1μldH2O3.5μl②加

6、入5μl（等量）的SolutionI。③16℃反应45分钟。4、重组DNA的转化实验原理：转化技术的关键在于制备感受态细胞，本实验是利用CaCl2转化法，细菌在低温，低渗的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失去细胞壁，外来DNA可形成粘合物黏附在细胞表面，经过42℃短暂热冲击，使DNA复合物进入细胞。4、重组DNA的转化实验步骤：连接产物10l冰浴中30分钟混匀42℃水浴90秒冰浴1-2分钟勿动＋加入800lLB培养液37℃振荡培养45分钟感受态细菌100l涂板培养过夜热激5、重组DNA的筛选实验原理：载体DNA控制产生的产物α-肽与宿主菌染色体上的DNA控制产生的产物ω-

7、肽，结合为具有完整β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。在诱导剂IPTG的作用下，细菌可产生蓝色菌落。当外源DNA插入到载体质粒的多克隆位点后，无法形成具有完整β-半乳糖苷酶活性的蛋白质，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落5、重组DNA的筛选①培养基平板的准备：分别在加有抗生素（氨苄青霉素(Amp)）和没有加入抗生素的琼脂平板上加40ulX-gal储存液和4ulIPTG溶液；②设置对比组及涂布：取转化菌若干与受体菌液若干，与预先加入的X-gal和IPTG混合，用无菌玻璃涂布器把溶液涂布于整个平板的表面