绿色荧光蛋白的克隆

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1、绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达摘要实验目的在于利用大肠杆菌的快速繁殖来克隆绿色荧光蛋白基因，从而来大量生产绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein），方法:通过对目的基因的提取，合适质粒的选取，构建基因工程所需的重组体，利用基因工程的方法，PCR技术，大量克隆目的基因，最后利用合适的技术又到基因表达，对产物检测后，确定目的基因是否达到克隆目的。关键词绿色荧光蛋白大肠杆菌基因工程PCR技术1前言绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP，是一类存在于包括水母、水螅和珊

2、瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还

3、需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。在生物学研究中，科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。而且在一些方面，如分子标记、药物筛选、融合抗体、生物传感器等方面。除此之外，绿色荧光蛋白在很多的领域存在着巨大的前景。本实验拟从含有GFP基因的生物中提取GFP基因，并在工程菌中克隆出该基因。2实验

4、目的从含有目的基因的生物中提取出GFP基因，按照基因工程的操作方法对目的基因进行克隆，最后对克隆产物进行鉴定。3实验原理103.1目的基因的分离及运载体的选择3.1.1目的基因的分离目的基因是指待测或待研究的靶基因，在分子克隆中，通常需要将这些基因从细胞中分离出来，在体外或体内进行一系列的研究。目的基因通常可以通过多种途径来实现分离，如从基因组内直接分离，人工合成，从基因文库内提取，PCR扩增等方式来实现。3.1.2质粒的分离和纯化质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。质粒DNA可持续稳定

5、地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。3.1.3PCR技术单菌落或提取的质粒DNA也可以通过PCR方法鉴定正确克隆。聚合酶链式反应（Po

6、lymeraseChainReaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，沿模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。具体地说，PCR反应系统有寡核苷酸引物，反应缓冲液，热稳定DNA聚合酶（Taq酶），脱氧核

7、苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分组成，缺一不可。PCR技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段扩增106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。5’-GG↓CC-3’3’-CC↓GG-5’。3.2酶切及连接5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↓G-5’II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoRI、HindIII、BamHI和NotI10这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而

8、识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoRI识别GAATTC；HindIII识别AAGCTT;BamHI识别G↓GATCC;NotI识别GC↓GGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如BglI识别GCCNNNNNGGC）。限制