绿色荧光蛋白分子实验.ppt

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1、绿色荧光蛋白报告基因的克隆基本原理：多聚酶链式反应是DNA的体外酶促扩增。是利用两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，使目的DNA片段在一定时间以指数方式增加百万倍。1.PCR扩增获得目的基因1、dNTP的质量与浓度——dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。2、模板（靶基因）核酸——模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。3、Mg2

2、+浓度——Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。4、退火温度对PCR的特异性有较大影响。5、变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。6、循环数——过多易产生非特异扩增。影响因素：7、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致

3、假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。8、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。9、变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。10、靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染

4、，导致假阳性；二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。实验结果pcr扩增获得目的基因的凝胶电泳图PCR产物引物模板跑胶条带几乎看不到。基本原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。注意事项及影响因素：1.对于琼脂糖

5、凝胶电泳，浓度通常在0.5~2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。2、凝胶电泳回收目的基因2、电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。3、注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去

6、除多余的盐，用酚可以去除蛋白。4、注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mMNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。5、正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。实验结果条带清晰。PCR产物回收的检验电泳图。原理：在Mg2和ATP存在下，T4DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。影响DNA连接反应的因

7、素：1、连接缓冲液的影响：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。2、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，低温连接较长的时间可取得较好的连接效果。3、目的基因与载体的连接3、酶浓度的影响：日常

8、使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。4、DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物，DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。要求线性化的连接产物，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。实验原理：转化(Transformation)是将异源DNA分子引入另一原核细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。感受态细胞：在自然条件下