活细胞的分子探针——绿色荧光蛋白

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1、维普资讯http://www.cqvip.com·279必然的相关性；⑧根据截短多肽迁移的长度，展．相信灵敏度更高、适用范国更广的技术将可以确证突变发生在cDNA或基因上的相不断涌现。对位置，从而有利于进一步的测序分析；④由参考文献于这种技术揭示的突变产生的截短的蛋白产物是疾病发生的诱因。因而避免了区分其它lRoestPMAetHomMoIGenet．1993；21719相关的病理性突变的困难．这在其它的突变20ritaMelalGenom[cs．1989；5f874检测中是不易做到的3WhiteMBe‘．

2、Genom~es，1992{123101996年，Becker等又发展了非放射4ForrestSMetd．AmJHomGenet．1991I49性蛋白截短检测方法(non．radioactivePTT，175nrPTT)，即以生物素代替放射性s作为检5PowdlSMa1．NewEngl】Medt1993j329测标记其优点有t①安全性高，检测中不再1982使用放射性物质}②生物索标记的敏感度不6LilIBa1．CancerRes，1994I54{4590亚于放射性标记}@nrPr的检测时间(77Hamiho

3、netalNewEnglJMedt1995{332h)几乎比放射性PTT(9～15h)缩短了一839半；④标记有生物素的蛋白可以长期保存，8Ntcolaldesa1．Nature，1994；371{75而S标记的蛋白由于半衰期的限制无法做9XiaLetaLCancerRes，l996I56{228910PlummetS．HumMolGenet。1995·4到这一点}⑤可以利用生物素与亲和素的亲1989和作用，过柱来分离需要的翻译蛋白产物。11HogervorstFBalNatGenet。1995I1QPTT

4、作为一种新的突变检测方法，丰富208了当前的突变检测体系。但突变检测的方法12j'ohanssonO“dAmJHumGenet．1996是多种多样的每一种方法均有其显著的优58≈441缺点因此，研究者往往需要根据自已的研究13BeckerKFat．TIG．1996；12{250目韵选择最适合方案。随着分子生物学的发(1996—12—1B渡墙)277~2活细胞的分子探针——绿色荧光蛋白张鸿卿V本绍白Qf口哆北京师范大学生物系细晦生物学研究室(北京。100875)摘要来自水母的绿色荧光蛋白(GFP)，在不加外痨

5、c物质的情况下．紫外光激发后，能在原按和真核活细胞中发绿色荧光．荧光性质稳定。突变蛋白发光效率提高，激发和发射光谱明显改变。GFP是一种十分有用的活细胞分子探针。在基因表达调控．转基因动物研究，蛋白在细晦中功能定位，迁移变化，病原菌侵入活细胞的分子过程等诸多方面均有广泛的用途。关键词．堡垒苎垄墨宴一塑!!塑；{势；名私曰乜随着对基因的表达调控．蛋白质在活细胞中自然状态下的变化等重要问题研究的深维普资讯http://www.cqvip.com·280·入，迫切需要一种操作方便，不用加外源底的荧光必须依赖于水母

6、细胞的其它成分algfp物，就能在活细胞中检测的分子探针。1994cDNA接在T7启动子下在大肠杆菌中表●年发现的绿色荧光蛋白~grcenfluorescent达，不加任何外源底物，紫外光激发就能观察—●protein，GFP)[13就能满足以上要求，它将彻到绿光}与线虫mec一7基因相连，可观察到4底改观过去的研究方法，在分子生物学研究种接触受体神经元的细胞体中有明显的荧中有广阔的应用前景。光[”。说明GFP不需要任何水母细胞中的有关物质或外加底物，就能在原核和真核细胞1GFP的性质中发光。gfpcDNA

7、从水母(Aequorea口tor)中2GFP的优点分离得到。研究水母的发光机制时发现：Ca和腔肠索(coalenterazine)与水母发光蛋2．1不用加任何底物．激发后就能发荧光，白(aequorin)结合后，水母发光蛋白发蓝色荧先性质稳定荧光，同时激发GFP，使其发出绿色荧光。前所用的报告基因，常有一些不尽人gfP由3个外显子组成+长达2．6kb；GFP意之处。如氯霉素乙酰转移酶(ehroampheni—是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，分子colacetyltransferase，CAT)基因，对C

8、AT量为27kD，其蛋白性质十分稳定，能忍受60的活性测定，必须用标记的氯霉素。薄层℃盼处理。用6mol／L盐酸胍92℃，2rain层析后，液闪测定，不仅操作繁琐，费用昂贵，或酸处理pH2，5rain变性后，GFP仍能复同位素废液的处理极为麻烦。后来用荧光脂性，恢复荧光，其半复性的时间少于5rain，酶(1u~iferase)等报告基因，仍．莆外加荧光在pH7．0时；重新复性的GFP最大的激发索，才能检测。而要在