双链DNA荧光探针同时用于细胞表面分子的荧光成像和数目定量

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1、分类号：密级：UDC：学号：407332415004南昌大学硕士研究生学位论文双链DNA荧光探针同时用于细胞表面分子的荧光成像和数目定量DoublestrandedDNAfluorescenceprobesareusedforfluorescenceimagingandquantitativedeterminationofcellsurfacemolecules.刘洋培养单位（院、系）：生命科学学院指导教师姓名、职称：陈勇研究员申请学位的学科门类：理学学科专业名称：细胞生物学论文答辩日期：答辩委员会主席：评阅人：年月日摘要摘要在生物实验中常常需要对细胞表面或内部的分子进行染色成像以及

2、对分子的含量进行测定。通常这两部分实验需要两套系统分开进行，例如，通过免疫荧光探针和荧光显微镜结合的方法进行细胞分子成像；而分子含量的测定通常要经过目标分子的分离、纯化后再进行BCA、ELISA等测定，不能对分子含量进行原位测量。激光共聚焦显微镜虽然能同时进行成像和荧光强度定量，其荧光强度定量不能精确定量分子的数目。我们实验室前期已成功构建了一种基于双链DNA的荧光探针，用于细胞表面分子的荧光成像，分别是biotin-DNA/SYBRGREEN和Biotin-DNA-ROX。这里存在两大缺陷：（1）由于只偶联了一分子的ROX，Biotin-DNA-ROX探针进行细胞成像时荧光较弱；（

3、2）两类探针都只能通过biotin（生物素）与亲和素特异性识别和结合，要对细胞表面某个蛋白染色的话，需要进行多级偶联（例如，中间还需要针对那个蛋白的抗体），不但会增加多个染色步骤，还无法进行双分子同时成像。本课题的目的有两个：（1）改善我们已构建的双链DNA荧光探针，使之在细胞表面分子荧光成像方面更加完美；（2）构建一种细胞表面分子原位定量的全新方法，使我们的双链DNA荧光探针，既能用于细胞表面分子的成像，又能对细胞表面分子进行原位的分子数目定量。本课题包含三个部分：（1）DNA的制备及鉴定（制备DNA，然后从分子水平和细胞水平上进行鉴定）；（2）解决我们已有的双链DNA荧光探针中的

4、两个问题，同时验证该双链DNA荧光探针能够用于对细胞表面的分子进行荧光成像；（3）验证该双链DNA荧光探针能够用于对细胞表面的分子进行原位数量定量。实验结果证明，我们的双链DNA荧光探针，既能用于细胞表面分子的成像，又能对细胞表面分子进行原位的分子数目定量，而且，方法简单、快捷、有效，成本低廉。关键字：荧光探针；双链DNA；荧光成像；分子定量IAbstractAbstractInbiologicalexperiments,itisoftennecessarytoperformstainingimagingonthesurfaceorinternalmoleculesofthecell

5、sandtodeterminethecontentofthemolecules.Normally,thetwoexperimentsrequiretwosetsofsystemstobeseparated.Adouble-strandedDNA-basedfluorescentprobehasbeensuccessfullyconstructedinourlaboratoryforfluorescentimagingofcellsurfacemolecules.respectivelybiotin-DNA/SYBRGREENandbiotin-DNA-ROX.Therearetwom

6、ajordefects:(1)Thefluorescenceofthebiotin-DNA-ROXprobewaspoorwhenthecellimagingwasperformedbecauseonlycouplingoneROX;(2)Bothtypesofprobescanonlybespecificallyrecognizedandboundbybiotin(biotin)andStreptavidin.Ifacertainproteinonthecellsurfaceistobestained,multi-levelcouplingisneeded(forexample,t

7、hemiddleoneneedstoProteinantibodies),multi-levelcouplingnotonlyincreasethenumberofstainingsteps,butalsoallownotsimultaneousimagingoftwomolecules.Thepurposeofthistopicistwofold:(1)Toimprovethedouble-strandedDNAfluorescentprobesweha