医学6fcm 定量细胞参量和荧光探针修改课件

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1、FCM定量细胞参量和荧光探针河北省肿瘤研究所左连富一、细胞参量能够被FCM定量分析的细胞参量很多,人们把这些可供检测的细胞参量分为内部和外部参量,同时又将内部与外部参量分为功能性和结构性参量。(见表7)流式细胞术可测量的细胞参数主要测量参数分为结构和功能两部分*结构参数*功能参数细胞大小与形态氧化还原酶状态胞核与浆比值表面电荷和膜电位色素颗粒酶活性亚细胞成分PH值，膜的流动性DNA.RNA.蛋白质含量线粒体膜电位细胞表面抗原DNA的合成能力硷性蛋白细胞内和膜受体染色体结构细胞浆和膜的钙离子细胞表面糖元等细胞

2、凋亡等二、定量细胞荧光染色原理定量细胞荧光染色,要求细胞成分染色的均匀性,保证染色做到染料分子数与被染的某种参量成一定量效关系,在流式定量分析中,掌握好荧光染色液的浓度非常重要,为了更好地说明这个问题,可以下式表示：F=Q(I-eεCL)F表示荧光强度I表示激发光强度Q表示光量子产额ε表示消光系数C表示染液浓度L表示溶液厚度当激发光增强时,荧光强度相应按比例增加,当荧光强度达到1.0时,继续增强光密度,荧光强度不会增加,还会造成结合到细胞上的荧光素发生猝熄现象,一个荧光分子发射的荧光有可能被邻近的分子吸收猝熄,由于这种猝熄现象,如再增加荧光染液浓

3、度也不会使荧光强度增大。1.荧光染色与细胞参量结合的方式⑴以共价键结合方式的荧光染色，使DNA链的连结之间以原子结合方式被打开，形成与荧光染料分子共价结合的方式，例如FITC、PE(藻红素、藻青素、德州红)这种荧光染料冲洗过多，易造成荧光分子丢失。⑵插入性或称嵌入性结合方式，荧光染料分子直接嵌入到核酸碱基对之间，这种方式结合紧密、稳固,不易造成荧光染料分子的丢失，如溴化乙啶(EB)、碘化丙啶(PI)、7-氨基放线菌素D(7-AAD)等。⑶结构亲合方式，以静电力结合，带有正电荷的荧光分子与带有负电荷的核酸中的磷酸相互吸引而结合，这种方式结合极弱，常

4、造成荧光分子的丢失，例如：丫啶橙与核酸单链结合时,派若宁与单链核酸结合系以静电力方式。2.定量荧光染色的评价标准⑴特异性：所用荧光染料与所感兴趣的细胞成分是否为特异性结合。⑵量效关系：在相同的条件下，荧光染料分子与研究的细胞成分的结合是否具有一定的量效关系。⑶荧光显微镜下观察，荧光的分布是否具有一个核形态结构，荧光分布是否均匀一致，并可看到一些荧光颗粒。⑷流式定量分析评价，(以DNA为例)，在DNA组方图上，G0/l峰与G2M峰是否成倍数关系。⑸荧光染料分子被光激发后，荧光强度是否与光强度、消光系数、量子产额成正比。三、细胞内部结构参数的FCM检

5、测1.细胞大小与形状、颗粒性质:流式细胞术对细胞大小和形状的检测，是最常见的功用，使用光散射可对不染色的细胞或染色细胞进行体积大小和形状的分析。已有作者采用前向散射即小角散射(0.5-1.5°)与侧向散射(90°散射)对全血细胞的体积大小分布进行了研究，得到各亚群的二维体积分布图，侧向散射并获得一些细胞颗粒性质的有用信息。有人用一个10μm标准微球作为体积大小的标准。作为计算各群细胞体积的实际大小。根据FCM定量细胞大小，也可对死活细胞进行鉴别。活细胞体积一般比死细胞体积大，有作者对凋亡细胞的研究发现，随细胞凋亡过程的进展，细胞皱缩，乃致形成核小

6、体时前向散射减小，侧向散射也减小。扫描流式细胞仪可对细胞进行形状和面积核浆比值，核的位置等多参量的分析。可提供细胞形态多种信息供参考。2.细胞自发荧光参量FCM检测:大部分哺乳类动物细胞内的吡啶或黄素类核苷酸都存在自发荧光，可用紫外光激发出蓝色荧光或用蓝光激发出绿色荧光。许多研究人员应用FCM进行了细胞自发荧光的探讨。有作者用氢离子激光488nm进行激发，对小鼠的淋巴细胞的自发荧光进行了测量，其自发荧光量相当于10000个荧光素分子与抗体结合发出的平均荧光强度相似。研究发现中性白细胞有较高的自发荧光，嗜酸性白细胞的自发荧光光谱中核黄素相似。在19

7、87年日本学者就利用FCM对胃粘膜细胞自发荧光进行了探索，发现早期胃癌细胞的自发荧光比正常胃细胞自发荧光强，由此用于早期胃癌的诊断。在人类细胞中的一些色素(如黑色素、脂褐素、血色素等)和一些氨类物质以及植物细胞中起光合作用的叶绿素均可在适当光谱线的激发下，而产生自发荧光。还有一些禽类、鸟类、鱼类的有核红细胞，在醛类固定剂固定后，其细胞核DNA均可产生较强的自发荧光。文献中已报道了鸡红细胞用戊二醛固定48小时后，经488nm的激发光激发而产生较强的自发荧光(详见“FCM标准样品及其作用”一章)。四、细胞的外部结构参量FCM检测测量细胞外部结构参量必

8、须用荧光染色，在荧光标记后才能通过FCM的检测，以获得细胞内结构和功能的信息，下面重点介绍一些细胞外部参量和常用的荧光探针。㈠细胞DNA