甘蔗14―3―3基因真核表达载体构建和研究

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1、甘蔗14—3—3基因真核表达载体构建和研究摘要：该实验拟构建甘蔗14-3-3基因的真核表达载体，为体外研究该蛋白功能和高级构象特征奠定基础。用RT-PCR技术从甘蔗茎中扩增出编码14-3-3蛋白的全长基因,并连入pGEM-T载体中，双酶切和测序用于序列正确性的鉴定。结果表明，该基因的最大开放阅读框为771bp,编码256个氨基酸。后将所得cDNA片段亚克隆至真核表达载体PPIC9K,经电转后在酵母细胞中表达，表达产物经Westernblot鉴定分子量约为28kDo表明已成功构建了甘蔗14-3-3蛋白真核表达载体，并获得了表达产物。关键词：甘蔗；14

2、-3-3基因；表达载体中图分类号S66文献标识码A文章编号1007-7731(2013)21-17-0314-3-3蛋白是一种酸性二聚体可溶性蛋白,是高度保守并在真核生物中普遍存在的一类调节性蛋白，可通过识别特异的磷酸化序列与靶蛋白相互作用［1］。近几年来，有关植物14-3-3蛋白的研究己取得较大进展(如：参与多种植物激素信号转导、各种代谢调控、物质运输和光信号应答等调控过程)，使之成为生物化学及信号途径研究领域中的前沿课题［1-2］o然而，14-3-3蛋白与一些蛋白之间的相互作用机制仍不清楚。与模式植物相比，14-3-3蛋白在甘蔗等一些经济作物上

3、的研究仍然很少，尤其是通过改变14-3-3蛋白活性进而来调节和影响植物发育代谢相关的信号通路，以提高作物的品质和产量，尚有待进一步研究探讨。本课题组前期克隆得到一个编码甘蔗14-3-3的基因，发现其与玉米和高粱蛋白的同源性较高，并通过相关软件和网站对14-3-3蛋白结构特征进行预测和解析，发现一些功能活性位点（已被《南方农业学报》收稿）。有研究表明14-3-3蛋白调节功能的行使依赖于靶蛋白磷酸化来发挥作用［3］,不仅调控许多关键信号蛋白（如BZR1.RSG和CDPK1等）的信号转导，而且可以作用于同一信号通路上不同的信号蛋白⑵。再者，14-3-3蛋

4、白虽然高度保守，但其N-端和C-端均具有较高的变异性，这一特征可能与14-3-3蛋白功能的差异性相关［4］。为明确甘蔗14-3-3蛋白激酶结构域和N-端及C-端的功能，本研究通过构建真核表达载体，用双酶切和测序技术加以验证，最后使用WesternBlot检测蛋白的表达量和纯度,为了解蛋白功能活性位点及下游信号转导研究奠定基础。1材料与方法1.1试验材料与试剂甘蔗（S.officinaramL.）茎段采自中国热带科学院南亚热带作物究所甘蔗种质资源料立刻放于液氮中处理，并置于❷8（rc保存备用。一链合成试剂盒、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq

5、DNA聚合酶均购自TaKaRa公司；RNA提取试剂盒购自天泽生物公司；胶回收和质粒提取试剂盒购自美国OMEGA生物技术有限公司；pGEM-TEasyVector购自Promega公司；其它生化试剂为国产分析纯。1.2甘蔗总RNA提取和14-3-3基因扩增甘蔗总RNA提取使用天泽生物公司RNA提取试剂盒，具体操作根据说明书进行。DNAstar、Primer5.0和DNAman等软件用于序列分析和引物设计。mRNASelectivePCRKitVer1.1一步法（TaKaRa）对目的基因进行RT-PCR，反应体系为：2XmRNA选择性PCR缓冲液I25

6、uL、MgC1210uL、dNTP混合剂5uL、RNase抑制剂1uL、逆转录酶1□L、正反向引物各1uL（正向引物：CGGAATTCCGATGTCGAGGGAGGAGAATGTT含有EcoRI的酶切位点；反向引物：TTGCGGCCGCCTCCGAAGATTACTGTCCCTCG含有Notl的酶切位点）、约1Lig总RNA、混合模板1UL、最后加入无RNaseH20至总体积50uL,扩增程序为50°C15min；85°Clmin,63°Clmin,72°C2min,共38个循环，72°ClOmin,-20°C保存备用。反应结束后，取上述扩增产物于含

7、EB的1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统下观察电泳结果。回收PCR产物与pGEM-TVector（Promega公司）连接，转入DH5a中，验证阳性克隆后呈送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.3PCR产物的回收、连接和转化PCR产物回收依据OMEGA琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒说明进行，后与pGEM-T载体在4£条件下连接过夜。将上述连接产物转入DH5a感受态细胞，通过蓝白斑和酶切双重手段对阳性克隆进行筛选。1.4pPIC9K-14-3-3表达载体构建结合引物设计的酶切位点，用EcoRI和NotI对PCR产物进行双酶切，将目的片段经

8、琼脂糖凝胶电泳分离后与PPIC9K表达载体相连(图1),10uL反应体系为：T4DNA连接酶luL,反应BufferluL