突变型人app基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建

《突变型人app基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建张丽娟王凤斌成敏刘蓉【摘要】目的构建携带突变型人淀粉样前体蛋白基因(APP695)与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合载体。方法在NCBI上查找APP695的序列，设计引物。以pCB6质粒携带的野生型APP695序列为模板，以突变体引物扩增突变型APP695。将突变型APP695与pIRES2EGFP连接并测序证实。结果经过酶切鉴定、PCR和DNA测序等方法，证实构建的pIRES2EGFP/APP695突变型质粒载体序列正确。结论成功构建APP695EGFP融合基因载体，为研究AD发病的分子机制和治疗时的

2、药物筛选奠定基础。【关键词】瑞典突变APP695；增强型绿色荧光蛋白；APP695EGFP融合基因；载体【Abstract】ObjectiveToconstructandexpressarebinantvectorbearingfusiongeneofhumanamyloidprecursorprotein(APP)695mutantgeneandenhancedfluorescenceprotein(EGFP)fusiongene.MethodsTheprimersNCBI.ThenthemutantAPP695plifedbyPCRanAPP695andactin

3、gasatemplate,thegeneofmutantAPP695idofpIRES2EGFP/APP695mutantutantvectoredbydigestionofrestrictionendonucleases,PCRandsequencing.ConclusionsThepIRES2EGFPAPP695mutantfusiongenerebinationhasbeenconstructedsuccessfully,utantAPP695；EGFP；FusiongeneofhumanAPP695/EGFP;Vector　　淀粉样前体蛋白(amyloidp

4、recursorprotein，APP)基因是Alzheimer病(AD)已发现的诸多相关基因之一。APP基因某些位点的突变可以引发某些家族的早发性AD，故APP的突变在AD发病中的作用引起了广泛关注。本研究应用增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein，EGFP)作为报告基因，将APP695突变基因与其融合，构建突变型APP695EGFP融合基因载体，为进一步研究APP695突变在AD发病中的作用，以及筛选对AD有治疗作用的药物奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　携带野生型人类APP695的pCB6质粒，由美国加利福

5、尼亚大学细胞分子医学院许华熙博士惠赠。携带EGFP的pIRES2质粒载体，由潍坊医学院免疫学教研室保存，DH5α感受态细胞为潍坊医学院免疫学实验室冻存。NheⅠ、HindⅢ、SmaⅠ、XbaⅠ等限制性内切酶，T4DNA连接酶与TaqDNA聚合酶，引物等均购自上海生工生物工程技术服务公司。　　1.2方法　　1.2.1pIRES2EGFPAPP695融合基因重组质粒的构建　　将携带EGFP的pIRES2质粒载体用NheⅠ、HindⅢ酶切后，采用PCR扩增突变型APP基因，用Premier5软件设计PCR引物，以pCB6APP695野生型质粒载体DNA作为模板，PCR扩

6、增突变APP基因。引物序列为：TA1APPU：5＇attgctagcatgctgcccggtttggcactg3＇，TA2APPMU:5＇tctgaagtgaatctggatgcagaat3＇，TA3APPMD：5＇attctgcatccagattcacttcaga3＇，TA4APPD:5＇gttaagcttctagttctgcatctgctcaaag3＇。模式：引物TA2、3为一对反向互补的cDNA序列，但在其中引入两个LN,ML的突变，TA1、4包括了整个APP序列，并且含有NheⅠ、HindⅢ酶切位点(图1)。　　先将两个小片段进行PC

7、R扩增得到回收片段，片段大小分别为1785bp、303bp，将获得的两个小片段做PCR连接得到APP695突变全片段，进行PCR条件：94℃3min，循环程序：94℃变性45s，52℃复性45s，72℃延伸2min30s。PCR结束后，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外光下观察结果并照相。　　1.2.2PCR产物APP695突变基因全长连至pIRES2EGFP载体　　流程图见图2。经检测胶证实2088bp的PCR目的基因产物APP695，用低熔点琼脂糖电泳回收纯化后连接到pIRES2EGFP载体，进行质粒转化。　　1.2.3质粒DNA抽