lmp1与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒的制备

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1、LMP1与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒的制备李先茂，赵彤,朱梅刚,张三泉，张进华【关键词】聚合酶链反应ProductionoflentivirusofLMP1andGFPrebinantgene　　【Abstract】AIM:Toproducelentivirusoflatentmembraneprotein1(LMP1)andgreenfluorescentprotein(GFP)rebinantgene.METHODS:ThefragmentincludingalltheexonsofLMP1pl

2、ifiedbyRTPCRandofCMVpromoterinthelentivirusvectorFUGV.△8.9,envelopeplasmidVSVGandtargetplasmidFUGP1〕inemethod.ThevirusproducingcellsupernatantententofLMP1aintained.Thethreeplasmidsicroscopy.CONCLUSION:ThelentivirusofLMP1andGFPrebinantgenearesuccessfull

3、yproduced.　　【Keyembraneprotein1;polymerasechainreaction;lentivirus　　【摘要】目的:制备EB病毒LMP1与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因慢病毒.方法:采用RTPCR方法获得LMP1全外显子片段,使之克隆到带绿色荧光蛋白慢病毒表达载体质粒FUGV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGP1导入病毒包装细胞293FT，荧光显微镜检测基因的表达，包装成病毒后，收集病毒上清，浓缩，PCR鉴定.结果：限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT

4、PCR获得的LMP1cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合;LMP1准确克隆入FUGP1与GFP融合基因慢病毒，为研究EBV瘤基因LMP1在多种疾病中的作用机制提供适合的稳定转染细胞的载体.　　【关键词】潜伏膜蛋白1;聚合酶链反应;慢病毒　　0引言　　EB病毒(EpsteinBarrvirus,EBV)与淋巴瘤、鼻咽癌、传染性单核细胞增多症等多种疾病密切相关.该EB病毒可编码至少60种产物,其中潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein1,LMP1)具有广泛的细胞生物学功能〔1〕

5、，在Ｂ淋巴细胞体外转化和永生化的过程中起重要作用;经LMP1转化了的B淋巴细胞不仅在形态上发生了改变,而且具有使裸鼠致瘤的能力〔2,3〕.如何将基因高效转染及长期稳定表达成为人们研究的热点.近期研究者把目光投向了以Ⅰ型人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)为代表的慢病毒不仅具有可感染非分裂期的细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点〔4〕，而且对重组包膜质粒、包装质粒及重组目的基因穿梭质粒进行了改造后，极大降低了其自我复制能力,使

6、安全性大大提高，有望成为理想的基因载体〔5〕.我们采用RTPCR方法获得LMP1全外显子片段,并将其克隆入慢病毒表达载体并进行了序列测定,利用包装细胞293FT制备了慢病毒，旨在制备LMP1与绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）融合基因慢病毒，为研究EBV瘤基因LMP1在多种疾病中的作用机制提供适合的稳定转染细胞的载体.　　1材料和方法　　1．1材料　　质粒pCMV.△8.9,FUGV.△8.9为包装结构质粒，主要起病毒包装功能，表达酶蛋白形成病毒衣壳结构；VSVG

7、为包膜质粒;大肠杆菌JM109(本室冻存菌种);EBV感染绒猴Ｂ淋巴细胞株Ｂ95.8(本室冻存细胞株)一步法RTPCR试剂盒,购自Gibco公司;限制性内切酶BamHⅠ和Taq酶、T4DNA连接酶、RNaseＡ,琼脂(B.M.,宝灵曼);低熔点琼脂糖(FMC);dNTP,PCRmarker,普通琼脂糖、10g/LEB(华美生物公司);胰蛋白胨和酵母提取物(Oxiod);Tris碱(Ｍｅｒｋ);其他试剂(均为国产分析纯).　　1．2方法　　1．2．1引物设计根据EBV基因组(Ｂ95.8来源)序列,设计

8、合成了两条引物,上游和下游引物分别对应于EBV基因组的169474~169456bp与168163~168181bp处,并且引入了限制性内切酶BamHⅠ的识别位点(上海生工生物工程公司合成).　　1．2．2RTPCR法扩增LMP1cDNA以下所用的常规方法参照文献〔6〕.总RNA抽提用TRIzol试剂抽提Ｂ95.8细胞的总RNA,DNAseⅠ处理去除DNA污染.琼脂糖凝胶电泳观察有无降解,测定其在λ260与λ280下的吸光度,计算吸光度比值和总RNA的含量.逆转录反应