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1、LMP1与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒的制备论文李先茂，赵彤,朱梅刚,张三泉，张进华【关键词】聚合酶链反应ProductionoflentivirusofLMP1andGFPrebinantgene【Abstract】AIM:Toproducelentivirusoflatentmembraneprotein1(LMP1)andgreenfluorescentprotein(GFP)rebinantgene.METHODS:ThefragmentincludingalltheexonsofLMP1plifiedbyRTPCR
2、andofCMVpromoterinthelentivirusvectorFUGV.△8.9,envelopeplasmidVSVGandtargetplasmidFUGP1］inemethod.ThevirusproducingcellsupernatantententofLMP1aintained.Thethreeplasmidsicroscopy.CONCLUSION:ThelentivirusofLMP1andGFPrebinantgenearesuccessfullyproduced.【Keyembranepro
3、tein1;polymerasechainreaction;lentivirus【摘要】目的:制备EB病毒LMP1与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因慢病毒.方法:采用RTPCR方法获得LMP1全外显子片段,使之克隆到带绿色荧光蛋白慢病毒表达载体质粒FUGV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGP1导入病毒包装细胞293FT，荧光显微镜检测基因的表达，包装成病毒后，收集病毒上清，浓缩，PCR鉴定.结果：限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RTPCR获得的LMP1cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合;LMP1准确克
4、隆入FUGP1)具有广泛的细胞生物学功能［1］，在Ｂ淋巴细胞体外转化和永生化的过程中起重要作用;经LMP1转化了的B淋巴细胞不仅在形态上发生了改变,而且具有使裸鼠致瘤的能力［2,3］.如何将基因高效转染及长期稳定表达成为人们研究的热点.近期研究者把目光投向了以Ⅰ型人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)为代表的慢病毒不仅具有可感染非分裂期的细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点［4］，而且对重组包膜质粒、包装质粒及重组目的基因穿梭质粒进行了改造后，极大降
5、低了其自我复制能力,使安全性大大提高，有望成为理想的基因载体［5］.我们采用RTPCR方法获得LMP1全外显子片段,并将其克隆入慢病毒表达载体并进行了序列测定,.freelHⅠ和Taq酶、T4DNA连接酶、RNaseＡ,琼脂(B.M.,宝灵曼);低熔点琼脂糖(FMC);dNTP,PCRmarker,普通琼脂糖、10g/LEB(华美生物公司);胰蛋白胨和酵母提取物(Oxiod);Tris碱(Ｍｅｒｋ);其他试剂(均为国产分析纯).1．2方法1．2．1引物设计根据EBV基因组(Ｂ95.8来源)序列,设计合成了两条引物,上游和下
6、游引物分别对应于EBV基因组的169474~169456bp与168163~168181bp处,并且引入了限制性内切酶BamHⅠ的识别位点(上海生工生物工程公司合成).1．2．2RTPCR法扩增LMP1cDNA以下所用的常规方法参照文献［6］.总RNA抽提用TRIzol试剂抽提Ｂ95.8细胞的总RNA,DNAseⅠ处理去除DNA污染.琼脂糖凝胶电泳观察有无降解,测定其在λ260与λ280下的吸光度,计算吸光度比值和总RNA的含量.逆转录反应：使用SUPERCRIPTTMONESTEPＴＭRTPCRsystem进行逆转录PC
7、R.反应体系为:2μL(约为2μg)总RNA模板,2×反应液25μＬ,下游引物(10μmol/L)1μL,2.5mmol/LMgCl2溶液0.6μL,酶混合物1μL,最后用灭菌DEPC水补足至49μL,50℃下,保温60min.加上游引物(10μmol/Ｌ)1μL,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃,2min;94℃,40s→56℃,1min→72℃,1min30s,共35个循环;72℃延伸8min.取5μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析.1．2．3FUGP1重组质粒的构建目的基因与FUGP1cDNA酶切纯化产物5μL
8、(约0.4μg),Ｔ4连接酶1μL(1Ｕ),10×反应缓冲液1μL,用水补足至10μL,16℃连接20h.重组质粒的转化：CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α.将10μL连接产物加入100μL感受态菌中,冰浴30min,42℃热休克90s,立即静置冰浴2min,加入800μLLB培养基,37℃100r
