慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠t淋巴细胞中的表达论文

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1、慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达论文【摘要】本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统，并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道（PPT）元件、泛醌启动子（PUB）和绿色荧光蛋白基因（GFP）连接至pLO134载体，构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSVG）共转染293T细胞，12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞，在荧光显微镜下和应用流

2、式细胞仪（FACS）观察感染情况。结果表明：慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，FACS分析转染效率为（63.04±7.24）%，病毒滴度测定为（3.09±0.61）×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后.freelphocytesMediatedbyLentiviralVectorAbstractThisstudyidsystemofthelentiviralvectorcarryingthegreenfluorescentprotein(GFP)geneandtoinvestigat

3、etheexpressionofGFPinTlymphocytesofthemouse.Thepolypurinetract(PPT)element,ubiquinonepromoter(PUB)andGFPidpLO134usingsubcloningtechnologytoconstructplasmidpTK153.Humankideny293Tcellsidsystemcontainingpackagingplasmid△NRF,plasmidpTK153andenvelopeplasmidVSVGbyusingcalcium

4、phosphateDNAprecipationandtheexpressionofGFPicroscopeafter12hours.TheviralparticlesouseTlymphocytesatmultiplicityofinfection(m.o.i.)of3.TheexpressionofGFPinmouseTlymphocytesicroscopyandfluorescenceactivatedcellsorting(FACS).Theresultsshol.TheexpressionofGFPouseTlymphocy

5、tesandthetransductionefficacyidsystemoflentiviralvectorcontainingGFPgeneissuccessfullyconstructedandthetransductionefficacyishighinmouseTlymphocytes.KeyouseTlymphocytes;greenfluorescentproteingeneJExpHematol2007;15(1):125-128逆转录病毒载体（retroviralvector，RV）系统已被广泛应用于临床前及临床的基因

6、转移研究，虽然对其复制以及转导外源目的基因至细胞的相关机理研究得较为深入，但是逆转录病毒载体不能有效转导非分裂期细胞，因而其应用于临床基因治疗受到了一定的限制［1］。围绕这一问题，近年来人们把目光投向了来源于包括人类免疫缺陷病毒1（humanimmunodeficiencyvirus1，HIV1）在内的慢病毒载体（lentiviralvector，LV）。LV最大的特点是可以感染非分裂期细胞如神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞等［2］。我们构建了以HIV1为基础的LV三质粒系统，并以绿色荧光蛋白基因（greenfl

7、uorescentproteingene，GFP）作为标志基因，观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。LV三质粒系统的构建及鉴定用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ分别从pTK131、pTK145及pTK54切下PPT元件、PUB启动子及GFP基因，用T4DNA连接酶依次将PPT元件、PUB启动子及GFP基因连接至由BamHⅠ酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去除5'P的载体pLO134上，连接产物转化感受态细胞DH5α，同时设立空白对照。37℃过夜培养，次日从连接板挑取6-8个克隆进行扩增培养，用Promega公司质粒小量提取试剂盒提取质粒后，分

8、别用限制性内切酶EcoRⅠ、SacⅡ和AgeⅠ+XbaⅠ鉴定连接产物的正反向。包装质粒△NRF、包膜蛋白质粒VSVG、pTK131、pTK145及pTK54均为本科徐开林教授构建。慢病毒载体包装细胞系的建