含热休克蛋白70和绿色荧光蛋白双顺反子慢病毒载体的构建与鉴定-论文.pdf

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1、‘16·空堡堡匿堂鲎查生旦箜鲞笙!塑inealthCareMed，Febmary2013，Vol15，N。．1·论含热休克蛋白70和绿色荧光蛋白双顺反子慢病毒载体的构建与鉴定常德，李开龙，潘春晓，郭英华，刘长庭[摘要]目的构建并鉴定人热休克蛋白70(Hsp70)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子慢病毒表达载体．以探索Hsp70对细胞保护作用的影响。方法通过基因重组技术将人Hsp70连接到含EGFP的慢病毒载体中，包装并收集病毒，感染人胰腺癌细胞系Aspc—l细胞后，通过荧光显微镜观察EGFP的表达，同时利用反转录一聚合酶链反应(R

2、T—PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)技术检测Hsp70基因的表达情况。结果酶切和测序鉴定Hsp70一IRES—EGFP双顺反子慢病毒载体构建正确．包装病毒感染细胞后荧光显微镜观察到细胞发绿色荧光，RT-PCR和westernblot检测均表明感染病毒后细胞Hsp70的表达量明显增加。结论成功构建了Hsp70一IRES—EGFP双顺反子慢病毒载体，为后续研究Hsp70的功能和作用机制奠定了一定的基础。[关键词]热休克蛋白70；增强型绿色荧光蛋白；应激；慢病毒载体[中图分类号]R373[文献标识码]Adoi：10．3969／．is

3、sn．1674—3245．2013．01．009ConstructionandidentificationofbicistroniclentivirusexpressionvectorforHsp70andEGFPgenecoexpressionChangDe，LiKailong，PanChunxiao，etal(NanlouRespiratoryDiseasesDepartment，ChinesePLAGeneralHospital，Beijing100853，China)[Abstract]ObjectiveToconstructabi

4、eistroniclentivirusexpressionvectorcarryingHsp70geneandEGFP．anddetectitsexpressioni13．humancancercellsafterinfection．MethodsHsp70～IRES—EGFPbieistroniclentivirusexpressionvectorwasc0n—struetedbylinkinghumanHsp70cDNAwithIRES—EGFPlentivirusvectors．Viruswerepackedbyeo-transfec

5、tingpMDL、pVSVG、pReyplasmidwithHsp70一IRES—EGFPvectorMlowedbyinfectingAspc一1cells．Theinfectedcellswereobservedunderfluores—cencemicroscopefordetectingEGFPexpression，andmeasuredbyRT—PCRandwesternblotfordetectingHsp70geneexpression．ResultsThebicistroniclentivirusexpressionvect

6、orcoexpressingHsp70andEGFPgeneswasconstructedandverifiedbyDNAse—quencing．TheEGFPandHsp70geneexpressionsweredetectedintheinfectedcells．ConclusionsTheHsp70——IRES——EGFPbi—cistroniclentivirusexpressionvectorhasbeenconstructedsuccessfully，whichhaslaidsomefoundationforstudyingth

7、efunctionofHsp70anditsmechanism．[Keywords]HeatShockProtein70；EGFP；Stress；Lentivirusvector热休克蛋白(heatshockproteins，Hsps)是一类等，参与细胞的许多生命活动，尤其是应激反应，是从低等生物到高等生物中广泛存在的应急蛋白质，一种非特陛细胞保护蛋白E34]。但在开展Hsp70的研最早在果蝇中发现，根据大小分为小分子热休克蛋究过程中，缺少一种能直接监测其表达的工具白(smallheatshockproteins，sHsps)、Hsp60、

8、Hsp70、绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是Hsp90以及Hspl005类[。其中Hsp70是热休克蛋一种最早在水母中发现的蛋白质，在蓝色