慢病毒载体PLKO．1-shHIF-2α的构建及鉴定-论文.pdf

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1、山东医药2014年第54卷第14期慢病毒载体PLK0．1一shHIF一2oL的构建及鉴定刘鹏飞。，崔春萍，门同义(1山东省医学科学院，济南250021；2济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院；3军事医学科学院放射与辐射医学研究所；4山东省千佛山医院)摘要：目的构建绿色荧光蛋白(GFP)标记的干涉缺氧诱导因子(HIF)_2仪表达的慢病毒载体，并对所得产物进行鉴定。方法体外合成的单链HIF一20【干涉片段经过退火后形成的双链片段和以质粒PCDH为模板扩增出的EF1一EGFP均与PLKO．1-puro连接，形

2、成重组的慢病毒载体质粒PLKO．1·shHIF-2c~，后者与pMD2G，pSAX2共转染293FT细胞中进行包装，产生重组慢病毒颗粒。用其感染786-0细胞，检测细胞中GFP表达情况。结果成功扩增出干涉HIF-2ot片段和EF1一EGFP片段，酶切鉴定及测序均证实PLKO．1-shHIF-2ct质粒构建成功。转染293FT细胞产生的重组慢病毒颗粒感染786-0细胞后高表达绿色荧光。结论成功构建了高效的带GFP报告基因并稳定干涉HIF-2ot表达的慢病毒载体。关键词：肾细胞癌；缺氧诱导因子_2d；绿色荧光蛋白

3、；RNA干扰6oi：10．3969／j．issn．1002-266X．2014．14．013中图分类号：Q291文献标志码：A文章编号：1002-266X(2014)14-0032-03近20年来肾细胞癌的发病率和病死率不断升放射与辐射医学研究所保存。引物设计：HIF一2仪干高¨．2J，已经成为男性中第7、女性中第8位的常见涉片段上下游引物分别为：5一CAACCTGCAGCCT—癌症。研究证实，缺氧诱导因子(HIF)在肾癌的发CAGTGTATC．3和5一CACCACGTCGTYCTrCTCGA—生中起重要作用

4、，其作为转录因子参与血管生成、肿T一3。根据NCBI提供的PLKO．1一puro病毒包装构瘤细胞的增殖、细胞的迁移等过程J。HIF由一个建手册合成包装慢病毒的片段(北京奥克生物技术仪亚基(HIF一1仪、HIF-2oL和HIF-3or)和一个G亚基公司合成)，序列如下：5-CCGGCAACCTGCAGCCT—组成。8亚基作为结构单位稳定存在，而亚基作CAGTG．ITCCTCGAGCACCACGTCGTTCTI'CTCGAT．为功能单位很不稳定，只有在低氧环境中存在；最近TG．3和5．AATrCAAAAACAAC

5、CTGCAGCCT—的研究表明HIF．2仅在肾细胞癌的致癌中起重要作CAGTGTATCCTCGAGCACCACGTCGTFCTTCTCGAT．用。为研究HIF．2表达对下游靶基因、细胞生物学3。以质粒PCDH为模板，设计EF1一EGFP片段上特征和致癌能力的影响，我们构建了带绿色荧光蛋下游引物分别为：5一GGAcTAGTAAGGATcT—白(GFP)并稳定干涉HIF-2c~的PLKO．1-shHIF-2e~GCGATCGCTCCGGT一3(含Spel酶切位点)和5-的慢病毒载体，并对所得产物进行了鉴定。现报告

6、CGGGATCCGCGACATCCGGTGGAGCCGGGT一3(含如下。BamH1酶切位点)，由北京奥克公司进行合成。1材料与方法1．2实验方法1．1材料2XTaqPCRMasterMix试剂购于北京1．2．1目的基因HIF．2干涉片段和EF1一EGFP片庄盟生物公司，凝胶回收试剂盒购于Promega公司；段获取体外合成的单链HIF．2干涉片段经过退DH5c~大肠杆菌感受态细胞购自北京天根生物科技火后形成双链片段(95℃4min，70℃10min)。以公司；大剂量质粒提取试剂盒购自Vigorous公司；小P

7、CDH质粒为模板，扩增EF1EGFP片段，用2×Taq剂量质粒提取试剂购自威格拉斯公司。限制性内切PCRMasterMix实行PCR(94cI=、30S，60oC、2酶BamH1HF、SpelHF、Age1、EcoR1和T4DNA快速rain，35个循环；72℃延长10rain)，PCR产物1％连接试剂盒购自NEB公司。人786-0细胞购于中琼脂糖电泳后胶切割并胶回收，得到EF1一EGFP片国科学院上海细胞库，质粒PCDH、PLKO．1．puro、段，预计约为1．3kb。pMD2G，pSAX2及293FT细胞

8、均由军事医学科学院1．2．2带GFP的慢病毒载体质粒PLKO．1-shHIF一2o【的构建分别用AgeI、EcoRI双酶切目的片段通信作者：门同义干涉HIF-2ot序列和PLKO．1．puro质粒(37℃水浴332山东医药2014年第54卷第14期定的细胞系。同时GFP性质稳定，通常不影响目的基因表达产物的生物学活性，能根据GFP融合蛋白的绿荧光的分布来分析目的蛋白在细胞中的分布和定位，并且可以利用