ALRsiRNA慢病毒载体最佳干扰序列的筛选及构建-论文.pdf

《ALRsiRNA慢病毒载体最佳干扰序列的筛选及构建-论文.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、临床检验杂志2014年4月第32卷第4期ChinJClinLabSci，Apr．2014，Vo1．32，No．4·267··基础实验诊断研究·DOI：10．13602／j．cnki．jcls．2014．04．08siRNA慢病毒载体最佳干扰序列的筛选及构建郭虹利，吴传新，郭晖，刘杞，杨超，孙航(重庆医科大学附属第二医院a．病毒性肝炎研究所，b．肝胆外科，重庆4000l0)摘要：目的筛选并构建肝再生增强因子(A衄)基因的最佳RNA干扰(RNAinterference，RNAi)慢病毒表达载体，为研究ALR基因表达下调后对肝癌细胞生物学特性的影响提供依据。方法针对A基因序列设计并

2、合成4个siRNA靶点，酶切连接GV118一GFP载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定；在包含A基因的质粒中以PCR法扩增出A基因，克隆至慢病毒载体GV143，构建A基因的过表达质粒，将RNAi重组慢病毒载体和A的基因表达质粒共转染293T细胞，用westernblot检测其对目的基因ALR的敲减效率。结果酶切鉴定证实成功构建了ALRRNAi慢病毒栽体及A基因过表达载体。不同浓度干扰质粒(0．4g和o．8p．g)的westernblot结果显示，相较于阴性对照组，KD1组ALR蛋白的表达水平(0．51±0．02，0．36-4-0．09)、KD2组ALR蛋白的表达水平(0．65．

3、4-0．04，0．49±0．02)、KD3组ALR蛋白的表达水平(0．62-4-0．07，0．52±0．02)均降低(P均<0．05)，而以KD1组蛋白表达量最低。结论成功筛选并构建了能有效沉默A基因的最佳RNAi重组慢病毒载体，为后续实验奠定基础。关键词：肝再生增强因子基因；RNA干扰；慢病毒载体中图分类号：R73文献标志码：AScreeningandconstructionoflentiviralvectorforoptimalsiRNAsequencetargetingt0ALRgeneGUOHong—li。，Chuan—xin，GUOHui。，Qi“，YANGChao

4、，SUNHang。(a．KeyLaboratoryofMolecularBiologyforInfectiousDiseases，MinistryofEducation，LiverDiseasesResearchandTreatmentCenter，b．DepartmentofHepatobiliarySurgery，theSecondafill—iatedHospitalofChongqingMedicalUn&e~ity，Chongqing400010，China)Abstract：0bjectiveToscreenandconstructalentiviralvecto

5、rofmosteffectivesiRNAtargetingtoaugmenterofliverregeneration(ALR)geneforprovidingpowerfultooltoinvestigatetheeffectofdown—regulationofALRgeneexpressiononbiologicalcharactersofhepatomacells．MethodsFourspecificsiRNAsequencestargetingtoAgeneweredesignedandsynthesized．ThesiRNAse-quenceswereclon

6、edintoGV118一GFPlentiviralvector．andthevectorswereidentifiedbyPCRandDNAsequencing．TheA职genewasamplifiedfromtheplasmidwhichcontmnsAgenebyPCR．TheALRgenefragmentwasinsertedintolentivirusvectorGV143toconstructALRgene—expressingvector．TheAgene—expressingvectorwasthentransfectedinto293Tcellswithth

7、esiRNArecombinantlentiviralvectors．WesternblotwasperformedtodeterminethesilenceefficacyforAgene．ResultsFollowingdigestionwithre-strictionenzyme，bothPCRandDNAsequencingdemonstratedthatthesiRNA—recombinantlentiviralvectorsandALRgene—expressingvectorwerecon