医学毕业论文热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定

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1、XX大学毕业论文热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定姓名：2014年6月25日热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定【摘要】目的构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体，为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAdHSP70,脂质体法转染人胚肾293细胞，包装产生重组腺病毒vAdvHSPo收获病毒进行滴度鉴定，RTPCR方法检测目的基因在Hela细胞的转录表达。结果PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体，

2、并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒；荧光显微镜卜•可观察到GFP的表达，收获病毒的滴度为3.2x1012U/Lo结论成功构建pAdHSP70重组腺病毒表达载体，且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录。【关键词】HSP70热休克蛋口质类腺病毒科遗传载体[ABSTRACT]ObjectiveToconstructrecombinantadenovirusexpressionvectorcontainninghumanHSP70andprovideabaseforinvestigatingtheprotectionofHSP70onthecellun

3、derstringentstate.MethodsTherecombinantadenovirusvectorpAdHSP70carryingHSP70wasconstructedwithAdEasysystemandthentransfected293cellstoproducerecombinantadenovirusvAdHSP70.Theviraltiterwastested.TheexpressionoftargetgeneinHelawastestedbyRTPCR.ResultsItwasconfirmedbyPCR,sequenc

4、ingidentificationandrestrictiveanalysisthatthetargetgenewasclonedcorrectlytotheshuttleplasmid.TheexpressionofGFPcouldbeobservedbyfluorescencemicroscope.Theviraltiterwas3.2x1012U/L,andRTPCRindicatedthatHSP70couldcftcctivclyexpressinHela.ConclusionRecombinantadenovirusvectorwas

5、constructedsuccessfullyandpackedin293cells.[KEYWORDS]HSP70heatshockproteins;Adenoviridae;Geneticvectors热休克蛋口70(HSP70)是一组高度保守的蛋口，作为一种重要的应激蛋白，HSP70可参与应激状态下细胞内蛋白的正确折叠、移位以及降解等，从而维持细胞的止常形态及功能，保证细胞的稳定性。研究结杲表明，HSP70在正常情况下表达水平很低或不表达，而在应激状态卜•细胞内热休克蛋白编码基因被激活，表现为表达上调。本研究旨在将外源性HSP70编码基因插

6、入含GFP标记基因的腺病毒载体屮构建重组腺病毒载体，经293细胞包装获得可高效转录表达HSP70的重组腺病毒，为探讨外源性HSP70表达对应激状态下靶细胞的保护作用捉供实验基础。1材料和方法1.1主要试剂和材料逆转录试剂盒购口美国Promega公司,限制性核酸内切酶PacI和PmeI为英国NEB公司产品；DNAMarker^限制性内切酶EcoRV和KpnI、T4DNA连接酶＞pMD18T载体为大连宝生物工程公司产品；TRIzol购白美国Invitrogen公司。携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,El区和E3区缺失的复制缺陷

7、5型腺病毒骨架质粒pAdEasy1,大肠杆菌JM109、BJ5183和DH10B以及人宫颈癌细胞系Hela和人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物学教研室捉供。1.2实验方法1.2.1RNA提取及逆转录合成cDNAHela细胞用含体积分数0.10的胎牛血清、105憾/L链霉索、105U/L青霉素的DMEM于37°C、体积分数0.05的CO2培养箱内培养。当细胞达80%汇合后，42°C水浴30min,然后迅速放冋培养箱屮继续培养8h,胰蛋白酶消化离心收集细胞，采用TRIzol-步法捉取细胞总RNA,按照逆转录试剂盒操作说明合成cDNAo1.2.2

8、H的基因的PCR扩增及TA克隆根据GenBank中编码HSP70的核昔酸序列及pAdTrackCMV载体的多克隆位点，采用Primier