热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定论文

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1、热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定论文【摘要】目的构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体，为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAdHSP70，脂质体法转染人胚肾293细胞，包装产生重组腺病毒vAdvHSP。收获病毒进行滴度鉴定，RTPCR方法检测目的基因在Hela细胞的转录表达。结果PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体，并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒；荧光显微镜下可观察到GFP的表达，收获病毒的滴度为3.2×1012U/L。结

2、论成功构建pAdHSP70重组腺病毒表达载体，且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录。【关键词】HSP70热休克蛋白质类腺病毒科遗传载体［ABSTRACT］ObjectiveToconstructrebinantadenovirusexpressionvectorcontainninghumanHSP70andprovideabaseforinvestigatingtheprotectionofHSP70onthecellunderstringentstate.MethodsTherebinantadenovirusvectorpAdHSP70carryingHSP70andthent

3、ransfected293cellstoproducerebinantadenovirusvAdHSP70.TheviraltiteredbyPCR,sequencingidentificationandrestrictiveanalysisthatthetargetgeneid.TheexpressionofGFPcouldbeobservedbyfluorescencemicroscope.Theviraltiterega公司，限制性核酸内切酶PacⅠ和PmeⅠ为英国NEB公司产品；DNAMarker、限制性内切酶EcoRⅤ和KpnⅠ、T4DNA连接酶、pMD18T载体为大连宝生

4、物工程公司产品；TRIzol购自美国Invitrogen公司。携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdEasy1，大肠杆菌JM109、BJ5183和DH10B以及人宫颈癌细胞系Hela和人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物学教研室提供。1.2实验方法1.2.1RNA提取及逆转录合成cDNAHela细胞用含体积分数0.10的胎牛血清、105μg/L链霉素、105U/L青霉素的DMEM于37℃、体积分数0.05的CO2培养箱内培养。当细胞达80%汇合后，42℃水浴30min，然后迅速放回培养箱中继续培养8h，胰蛋白

5、酶消化离心收集细胞，采用TRIzol一步法提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒操作说明合成cDNA。1.2.2目的基因的PCR扩增及TA克隆根据GenBank中编码HSP70的核苷酸序列及pAdTrackCMV载体的多克隆位点，采用Primier5.0软件设计扩增HSP70基因的特异性引物。并分别在两条引物中的5′端引入KpnⅠ和EcoRⅤ酶切位点以及保护性碱基。上游引物序列为：5′CGGGTACCCAACGACGGAGACAGCC3′，下游引物序列为：5′GCGATATCTCCAGCCACGAGATGACC3′，下划线部分为引入的酶切位点。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成

6、，扩增片段长度为1486bp。反应体系为：10×buffer2.5μL,MgCl21.5mmol/L,dNTP0.2mmol/L,上下游引物各0.3mmol/L，Taq1U,cDNA2μL，无菌去离子水补至25μL。扩增条件为：94℃预变性5min；然后94℃1min，70℃1min，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。取5μL扩增产物于1g/L的琼脂糖凝胶（含0.5mg/L溴化乙锭）中电泳，凝胶自动成像系统分析结果。自琼脂糖凝胶中回收纯化目的基因，然后与PMD18T载体在连接酶的作用下进行连接，将连接产物以1×TSS两步法转化E.coliJM109，涂布于氨卞抗性

7、的LB平板，37℃过夜培养。次日挑取平板克隆振荡培养后提取质粒，KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切鉴定筛选阳性克隆，产物送上海生工生物技术有限服务公司测序。1.2.3穿梭载体pAdTrackCMVHSP70的构建测序确证序列正确无误后，分别用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切目的基因片段和穿梭载体pAdTrackCMV，并在T4DNA连接酶作用下以摩尔比1∶3进行连接。将连接产物全部转化已准备好的感受态细菌JM109，取转化菌涂布