慢病毒载体介导的小鼠骨髓树突状细胞relb基因沉默

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1、慢病毒载体介导的小鼠骨髓树突状细胞RelB基因沉默：包杰,王前郑磊,裘宇容曾方银,杨春莉,黄宪章【摘要】目的:利用慢病毒载体沉默小鼠骨髓树突状细胞(DC)的RelB基因,建立RelB基因低表达的骨髓致耐受DC,为自身免疫病的防治提供新方法。方法:设计小鼠RelB基因干扰的靶序列R5,合成并克隆到慢病毒载体上,与慢病毒的包装材料在293FT细胞中包装成病毒颗粒,收集病毒上清,测定病毒滴度,然后包装慢病毒感染DC,RTPCR和免疫荧光方法检测,灰度扫描并用软件分析RelB基因的表达水平,未成熟DC作对照组,选择T6包装病毒为RNAi的阴性对照。结果:RTP

2、CR和免疫荧光方法发现R5病毒感染的DCRelB基因表达水平与未成熟DC基因表达水平接近,低于成熟DC的表达水平（P<0.05）,而实验对照T6组病毒感染的DC其RelB基因表达水平高于未成熟DC（P<0.05）和R5病毒转染DC组（P<0.05）。结论:小鼠骨髓DC表达的RelB基因被慢病毒载体有效沉默,有望成为DC免疫治疗的新载体。【关键词】慢病毒载体;树突状细胞;RelB基因;基因沉默RelB（avianreticuloendotheliosisviral(vrel)oncogenerelatedB）是核转录因子NFκB家族成员

3、之一,在树突状细胞(dendriticcells,DC)的基因表达调控中具有重要的作用［1］。我们前期的研究发现RelB基因的表达水平与DC的成熟状态有关,而DC的成熟与否决定了免疫反应的方向［2,3］。因此,DC在感染免疫、自身免疫、移植免疫、肿瘤免疫等免疫介导的疾病中都起着举足轻重的作用。利用未成熟DC具有诱导机体免疫耐受的特性,构建具有致T细胞免疫耐受的致耐受DC并应用于自身免疫病的免疫治疗目前已成为临床免疫治疗的一个热点。RelB基因作为影响DC发育成熟的关键基因,其表达水平的高低决定了DC的免疫功能。利用可高效、特异下调目标基因表达的RNAi(R

4、NAinterference,RNAi)技术可实现基因表达沉默。然而,RNAi效应与基因转移效率有密切关系。由于体外培养的骨髓DC对多种脂质体介导的基因转移效率均极低,严格限制了DC在临床免疫治疗中的应用以及DC疫苗的研制［4］。而慢病毒载体,具有既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞,还可整合到宿主细胞的染色体基因组上并具有免疫原性小等优点［5］,在基因治疗领域中最具发展前景,为DC的临床免疫治疗带来了希望。为此,我们利用RelB基因的RNAi慢病毒载体进行了小鼠骨髓DC的RelB基因沉默,构建了RelB基因低水平表达的致耐受DC,为DC治疗自身免疫性疾病和

5、预防移植免疫排斥问题作一探讨。1材料和方法1.1材料BLOCKiTTMU6RNAiEntryVector试剂盒、LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司;RelB的慢病毒干扰片段利用Invitrogen网站上的免费软件设计由上海生工生物工程有限公司合成;高糖DMEM培养基和RPMI1640培养基购自Gibco公司;PE标记的大鼠抗小鼠CD86(B72)mAb、PE标记的大鼠抗小鼠IA/IE单克隆抗体(mAb）和PE标记的大鼠抗小鼠CD40mAb均来自BDPharMingen公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;质粒Midi抽提

6、试剂盒购自Qiagen公司;Polybrene购自Sigma公司;C57BL/6小鼠（7～9周龄,SPF级）由南方医科大学动物研究所提供。1.2方法1.2.1小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体的构建按参考文献［6］方法构建小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体。简言之,根据网站（sirna/）提供的软件设计合成RelB基因（NM_009046）的特异性干扰片段,序列为R5(RelB)Topstrand:5′CACCGCTGCTCTGTGATGACCAGGTACGAATACCTGGTCATCACAGAGCAG3′;Bottomstrand:5′AAAACT

7、GCTCTGTGATGACCAGGTATTCGTACCTGGTCATCACAGAGCAGC3′,GC含量在35%～55%,在GenBank数据库进行BLAST分析其与其他基因的同源性。在干扰片段上游链(Topstrand)的5′端加上CACC四个碱基,在下游链(BottomStrand)的5′端加上AAAA四个碱基,环（loop）为CGAA。选择T6(mock)做为阴性对照,Topstrand:5′CACCGTTCCTTCTGACTAAAGTCCGTCGAAACGGACTTTAGTCAGAAGGAA3′;Bottomstrand5′AAAATTC

8、CTTCTGACTAAAGTCCGTTTCGACGGACTTTA