携带afp基因慢病毒载体制备并感染树突状细胞的实验研究

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1、携带AFP基因慢病毒载体制备并感染树突状细胞的实验研究：李明峰,侯静,熊伟民,邸立军,任军【摘要】目的:制备携带AFP基因的慢病毒,并体外感染树突状细胞(DC),制备AFPDC疫苗。方法:以人HepG2肝癌细胞cDNA为模板PCR扩增出AFP基因片段,将该片段克隆入慢病毒载体,构建成LentiAFP慢病毒载体。其后,用慢病毒载体转染293T细胞,包装慢病毒表达载体。通过酶切、PCR对LentiAFP慢病毒载体进行鉴定。包装好的慢病毒体外感染DC,制备AFPDC疫苗,流式细胞仪检测感染率,免疫荧光、RTPCR法及电化学发光法检测AFP表达。结果:

2、酶切、PCR鉴定证实,慢病毒载体插入片段为AFP基因。包装的慢病毒具有良好的感染性,可以在293T细胞中形成病毒颗粒,携带AFP基因的慢病毒感染DC,经免疫荧光、RTPCR法及电化学发光法证实DC能够表达转染基因AFP,并且不会影响DC表型,感染率高达78.91%。结论:成功构建携带AFP基因的慢病毒载体,感染树突状细胞后表达AFP,为DC疫苗在肝癌中的临床应用提供了实验基础。【关键词】甲胎蛋白;慢病毒;基因转染;树突状细胞甲胎蛋白(alphafetoprotein,AFP),是一种重要的胚胎期及肝癌相关蛋白,正常情况下新生儿出生后,AFP表达即被关

3、闭。但如果肝细胞发生癌变或发生化学或物理损伤时,AFP基因又可重新表达。AFP的表达量异常增高,临床上可作为肝癌的一个诊断和预后指标。因此,制备AFP特异性的疫苗,诱导针对AFP的特异性的免疫反应,可作为肝细胞癌治疗的一种新思路。树突状细胞(dendriticcell,DC)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞,它能够高效的摄取、处理抗原,并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞,引起针对该抗原的特异性免疫反应。DC应用于肝癌免疫治疗是目前的研究热点,用AFP基因修饰DC,一些方法被证实有效[1,2]。本研究中,我们构建了人AFP慢病毒表达载体,并应用该载体感染

4、DC,制备AFPDC疫苗,为DC疫苗在肝癌中的临床应用提供实验基础。　　1材料和方法　　1.1材料慢病毒载体系统(Tronolab)由中国科学院上海生化细胞所提供,该病毒包装系统为四质粒系统,组成为pRsvREV、pMDlgpRRE、pMD2G、PHⅠ、SalⅠ购自TaKaRa公司。包装细胞293T细胞株购自ATCC,高感受态DH5α购自博大泰克公司,转染用试剂TRIzol、Lipofectamine2000、胎牛血清、胰蛋白酶均购自Invitrogen公司。IL4、GMCSF及TNFα购自Bioscience公司,AFP肿瘤标志物检测试剂盒

5、购自罗氏公司,人肝癌细胞系HepG2为我科保存。　　1.2方法　　1.2.1PCR方法获取基因片段根据AFP基因信息设计基因合成引物:上游引物5′端带有BamHⅠ切点,下游引物5′端带有SalⅠ切点,上游5′ATTTGGATCCCGCCACCATGAAGTGGGTGGAATCAAT3′,下游5′AGACGTCGACTCATTAAACTCCCAAAGCAGC3′。根据说明书用TRIzol试剂从人HepG2肝癌细胞中抽提总RNA,并利用RTPCR反转录成cDNA,以该cDNA为模板利用上述引物做PCR扩增得到AFP基因片段。PCR反应体系为:模板

6、1μL,10×LABuffer2μL,dNTP2μL,KODPLUS1.0μL,Primers1.0μL,H2O加至20μL反应体系。PCR反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性45s、52℃退火45s和68℃延伸90s,循环数35,最后经72℃总延伸10min。目的产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收,获得AFP基因片段。　　1.2.2慢病毒载体LentiAFP的构建及酶切鉴定将PCR产物全部进行凝胶电泳后回收,对慢病毒空载体PHⅠ和SalⅠ进行双酶切,酶切目的片段用DNA纯化试剂盒进行纯化,再用T4连接酶将双酶切载体和目的基因片段进行连接反应。取

7、5μL连接产物转化入DH5α高效感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜。经PCR及BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定后筛选出正确阳性克隆,最后取一个正确连接的质粒送出测序进一步确认,即LentiAFP。　　1.2.3LentiAFP慢病毒的制备用磷酸钙法转染293T细胞制备LentiAFP慢病毒。将处于对数期生长的密度为2.5×106/L293T细胞接种于的10cm细胞培养皿中,37℃、50mL/LCO2培养箱内培养,24h后,当细胞密度达60%～70%时转染。磷酸钙沉淀1mL/10cm盘,向混合物(慢病毒质粒Pin,逐滴滴加入待转染的1

8、0cm盘。转染8h后吸去培养液,用PBS洗去残余磷酸钙沉淀,换新鲜培养液。72h