筛选携带rock2基因sirna有效片段的慢病毒载体

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1、中图分类号：R89；R36；R39硕士学位论文筛选携带ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒载体院（系）、所临床医学院研究生姓名彭强学科、专业外科学导师姓名姜睿教授二Ο一三年四月1目录1筛选携带ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒载体………………………………………………………………21.1中文摘要………………………………………………………31.2英文摘要………………………………………………………51.3前言……………………………………………………………81.4材料与方法……………………………………………………101.5结果…………………………………………

2、…………………301.6讨论……………………………………………………………381.7结论……………………………………………………………401.8参考文献………………………………………………………411.9英汉缩略词对照表……………………………………………442致谢……………………………………………………………453中医药治疗慢性前列腺炎的分子机制（综述）…………………………………………………………………462筛选携带ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒载体摘要目的：筛选能够显著抑制自发性高血压大鼠（SHR）阴茎海绵体平滑肌细胞内Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶

3、2（Rho-associatedcoiled-coilcontainingproteinkinase2，ROCK2）基因表达的携带siRNA的慢病毒载体。方法：1.采用组织块贴壁培养法分离培养SHR阴茎海绵体平滑肌细胞。2.靶向大鼠ROCK2基因设计具有基因特异性的小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)，构建其短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)重组慢病毒表达载体。①设计RNAi靶点序列并合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI、XhoI进行酶切后的GP-SupersilencingVe

4、ctor载体连接产生shRNA慢病毒载体。②转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落、扩增后提取质粒，进行DNA测序鉴定。③GP-SupersilencingVector与三种混合包装质粒共转染293T细胞，包装产生shRNA重组慢病毒。3.随机将5只SHR阴茎海绵体平滑肌4细胞分为6组（每组n=5），每组每个样本3×10个细胞，分别为：A组（未转染对照组）、B组（携带慢病毒转染组）、C～F组（分别携带靶向ROCK2基因的siRNA1～4号靶点的慢病毒转染组），以MOI=80转染SHR阴茎海绵体平滑肌细胞，转染后48小时荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，

5、并用RT-PCR检测各组被转染细胞ROCK2基因mRNA3的表达。结果：1.经酶切及基因测序鉴定证实重组慢病毒载体质粒构建成功。2.荧光显微镜下观察各组细胞感染效率均大于50%。3.RT-PCR方法检测转染后各组ROCK2mRNA的表达：与A组相比，B组ROCK2基因mRNA的表达无明显改变（P﹥0.05）；C组、D组、F组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组极显著下降（P<0.01），抑制效率分别达到43.91±8.19℅、47.15±6.64℅、25.7±6.03℅；E组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组显

6、著下降（P<0.05），抑制效率为16.81±5.94℅。结论：1.本研究成功构建了大鼠ROCK2基因RNAi慢病毒载体，为后续的改善SHR勃起功能的体内外实验奠定了基础。2.构建的4种携带ROCK2基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞内ROCK2基因的表达，其中有3种慢病毒载体抑制作用较强。关键词：SHR大鼠；ROCK2；RNA干扰；靶点筛选4ScreeninglentiviralvectorwithcarryingeffectivelysiRNAofROCK2geneAbstract:Objective：Toscreenlen

7、tiviralvectorcarryingsiRNAthatcouldsignificantlysuppresstheROCK2geneexpressioninthecorpuscavernosumsmoothmusclecellsofthespontaneouslyhypertensiverat(SHR).Method:1.WeusedtheorganizationaladherencemethodtoisolateandculturetheSHRcorpuscavernosumsmoothmusclecells.2.Todesignthesmallinte

8、rferenceRNA(siRNA)s