使用flag标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因rna干扰的有效靶点

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1、使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点：史艳侠，韩文杰，彭柔君，张景航，黄慧强姜文奇【摘要】【目的】筛选高效的foxp3RNA干扰的靶点用于阻断CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因shRNA序列，化学合成法合成4条shRNA序列，构建含foxp3的靶序列的慢病毒载体；构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点；【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒；成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞；在工具细胞上筛选出

2、了2条RNAi效率分别为91.3％和95.6％的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳靶点。【关键词】foxp3；FLAG蛋白；慢病毒载体,CD4+CD25+Treg，RNA干扰Abstract:【Objective】ToscreenthehigheffectiveRNAinterveningtargetsoffoxp3genetoblocktheimmunosuppressionofCD4+CD25+Tregs.【Method】FourshRNAsequencesicalmethod.Lentiviralvectorthatcons

3、iststargetsequencesoffoxp3entsaltargetsofFoxp3geneforRNAicanbescreenedbyFLAGfusionproteinandlentivirusvector.KeyAbIg亚类检测试剂盒均购自Sigma公司。RPMI1640培养基购自Gibco公司。小牛血清购自Gibco公司。羊抗小鼠foxp3mAb购自eBioscience公司。foxp3慢病毒载体由本试验室构建。Foxp3引物由上海吉凯公司合成,Foxp3-HindⅢ/Foxp3-KpnⅠ的引物序列为：Forersham公司。SDS-PAGE设备购自BIO-RAD公司。

4、流式细胞仪为美国BECKMAN-COUTER公司产品。1.4CD4+CD25+Treg细胞的分离颈脱臼法处死小鼠,取脾脏,在200目滤网上磨碎脾脏，红细胞裂解液裂解红细胞，按照小鼠CD4+CD25+Treg细胞磁珠分离试剂盒说明书进行操作，先阴性选择获得CD4+T细胞;加入FITC标记抗小鼠CD25单克隆抗体,再加入磁珠标记抗FITC,阳性选择获得CD25+T细胞,阴性选择获得CD25-T细胞,通过流式细胞仪(BDFACSCalibur)分析获得的CD4+CD25+T细胞纯度。1.5Foxp3总RNA抽提和RT-PCR测定foxp3mRNA水平取1×106细胞,加入1mLTrizol

5、,提取总RNA,根据试剂盒说明书进行操作，将总RNA反转录为cDNA。PCR总反应体系50μL，循环参数：94℃30min预变性，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，最后以72℃延伸10min。1.6表达mfoxp3的293T细胞制备回收mfoxp3PCR产物后进行HindⅢ＋KpnⅠ酶切，回收酶切片段后可以进入后续克隆构建入真核表达载体中。将pEGFP－C1:HindⅢ＋KpnⅠ酶切，回收4.7Kb片段，使用连接酶连接mfoxp3酶切产物和pEGFP－C1，形成mfoxp3R-seq+EGFP-C-F阳性克隆。PCR片段长度为701bp。将阳性克隆送上海Inv

6、itrogen公司进行3730型测序仪进行测序分析，引物序列如下：foxp3-HindⅢ，CAGATCTCGAGCTCAAGCTTGGATGCCCAACCCTAGGCCAGC；foxp3-KpnⅠ，GATCCCGGGCCCGCGGTACCTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAGGGCAGGGATTGGAGCACT；foxp3R-seq，AACCAGGCCACTTGCAGAC；EGFP-C-F，CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG。用无血清培养基把293T细胞悬液稀释到200～2000个/mL，在0.1mL的细胞悬液中加入0.1mL的4g/L的台盼兰溶液。轻轻

7、混匀，数分钟后计数细胞。取培养2～3d生长旺盛的细胞，用培养液将细胞配成2×106～2×107细胞/mL。在6孔培养板中每孔加入2mL细胞悬液，培养24h后细胞融合度控制在70%～80%。将6孔板的每个孔的培养液体积调整至1mL,用2×gmfoxp3DNA质粒与240(LDMEM混合。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀。混合后，在室温下温育20min，以便形成质粒DNA与Lipofectamine2000稀