小鼠基质金属蛋白酶9 rna干扰慢病毒载体在体外的沉默效应

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1、小鼠基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒载体在体外的沉默效应【摘要】目的探讨构建的小鼠基质金属蛋白酶(MMP)9RNA干扰(RNAi)慢病毒载体在体外工具细胞中的沉默效应。方法针对小鼠MMP9基因序列构建的MMP9过表达克隆质粒和RNAi慢病毒载体共转染培养良好的工具细胞(293T和NIH3T3细胞)，采用实时荧光定量PCR和MP9mRNA和蛋白表达的下调作用。结果构建的MMP9RNAi慢病毒载体能显著降低工具细胞中MMP9表达量。结论成功构建了能够抑制小鼠MMP9表达的RNAi慢病毒载体，为在体研究奠定了

2、基础。【关键词】基质金属蛋白酶9;RNA干扰;慢病毒载体　　【Abstract】ObjectiveToexplorethesilencingeffectoftheconstructedmice′smatrixmetalloprotEinase(MMP)9RNAinterference(RNAi)lentivirusvectorinvitro.Methods293TandNIH3T3cellsidandRNAilentivirusvector.RealtimePCRandMP9RNAilentivirusvecto

3、rsignificantlydecreasedMMP9expressionin293TandNIH3T3cells.ConclusionsRNAilentivirusvectorinhibitingMMP9expressionissuccessfullyconstructed,layingfoundationfortheresearchinvivo.　　【KeyetalloprotEInase(MMP)9;RNAinterference;Lentivirusvector　动脉粥样硬化(AS)斑块破裂是急性缺血事件

4、的主要原因。细胞凋亡和基质降解机制与斑块破裂过程有关〔1〕。循环中细胞外基质(ECM)标记物的水平常常与AS疾病的危险分层密切相关。基质金属蛋白酶(MMPs)降解ECM，破坏动脉壁的完整性，触发急性动脉血栓形成〔2〕。MMPs是与ECM蛋白质降解密切相关的蛋白水解酶，在组织重塑过程中起重要作用〔3〕，是造成AS斑块不稳定的重要原因之一。不稳定的人AS斑块局部MMPs的主要来源为单核细胞/巨噬细胞，而MMPs的主要成分是MMP2和9〔4〕。因此，抑制MMP9在不稳定斑块中的表达，可能抑制斑块破裂。为此，本实验构建小

5、鼠MMP9RNA干扰(RNAi)质粒，采用MP9干扰质粒在工具细胞中的沉默效应，为进一步在体研究奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料由上海吉凯基因有限公司构建合成并包装的MMP9RNAi慢病毒载体;DMEN、胎牛血清(Gibco公司);胰蛋白酶(上海化学试剂公司);Lipofectamine2000、Trizol(美国Invitrogen公司);兔GFP多克隆(Abcam公司);山羊抗兔IgGHRP(SantaCruz公司);预染的蛋白标志物(中晶公司);荧光显微镜(Olympus公司);实时荧光定量PCR

6、仪器(BioRad公司)。　　1.2方法　　1.2.1MP9表达将构建好的MMP9基因过表达克隆质粒和针对不同靶点RNAi病毒载体质粒，共转染入293T细胞，于转染后72h，收集培养上清行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用TBST(TBS+0.05%Tersham公司ECL+plusTMMP9mRNA的表达NIH3T3细胞慢病毒感染实验在6孔板中进行，分为正常对照组、阴性对照组和RNAi组。MMP9基因引物采用Beacondesigner2软件设计，上游引物：GG

7、CGTGTCTGGAGATTCG，下游引物：TACTGGAAGATGTCGTGTGAG;分别取转染后的NIH3T3细胞，按Invitrogen公司的Trizol操作说明书抽提细胞总RNA;RNA逆转录获cDNA，在Biorad的iQ5上完成实时荧光定量PCR检测。　　1.2.3荧光显微镜观察GFP表达将生长状态良好的NIH3T3，在病毒感染前一天分入6孔培养板培养，感染当天按实验设计的组别分别加入不同复合感染(MOI)的RNAi慢病毒颗粒进行感染实验。感染72h后荧光显微镜下观察GFP表达情况，进而判断MMP9的干

8、扰效果。　　1.3统计学处理采用SPSS11.0统计软件进行χ2检验。　　2结果　　2.1293T细胞中MP9有显著的敲减作用，在两个质粒浓度下的作用是一致的;3#也有一些敲减作用，特别是在高质粒浓度下;1#靶点基本没有作用，如图1。　　PC为MMP9阳性参照;NC1为共转染过表达融合蛋白质粒，加NCRNAi质粒的细胞组;NC2