慢病毒介导rna干扰技术制备骨桥蛋白基因沉默小鼠模型

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1、学校代码：10246学号：09211220070复旦大学硕士（专业）学位论文慢病毒介导RNA干扰技术制备骨桥蛋白基因沉默小鼠模型Osteopontingenesilencingmousemodelmadebylentivirus-mediatedRNAinterferencetechnology【本课题受国家自然科学基金（No.30801105)资助】院系：华山医院专业：临床医学（普外)姓名：享n满导师：陈进宏副教授导师小组成员：向阳副教授马保金教授蔡端教授完成日期:2012年3月12日复旦大学专业学位硕士论文目录目录中英文缩略词对照表1巾文摘胃2英文摘要4弓IW7第一部分靶向骨

2、桥蛋白基因的shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定11mm11材料与方法11親24舰28誠29参考文献30第二部分C57小鼠肝脏骨桥蛋白基因沉默动物模型的建立31前胃31材料与方法3137讨论4042参考文献42第三部分骨桥蛋白基因沉默C57小鼠肝脏胆固醇代谢相关基因表达的检测..44"iys44材料与方法44会課47i寸i仓49辦5152总结54综述55附件62致谢63?复旦大学专业学位硕L论文中英文缩略词对照表中英文缩略词对照表英文缩写英文名称中文名称OPNOsteopontin骨桥蛋白LVLentiviralvector慢病毒载体shRN

3、AShorthairpinRNA短发夹RNAsiRNASmallinterferenceRNA小RNA干扰BCBlankcontrol空白对照组NCNegativecontrol阴性对照组EGExperimentalgroip实验组TU/mlTranductionunitesperml每毫升转染单位E.coliEscherichiacoli大肠杆菌AMPAnpicillin氨苄西林LBLuria-Bertani溶菌肉汤MOIMul^licityofinfection感染复数GSGenesilencing基因沉默PTGSPosttranscriptionalgenesilencing转录后基因

4、沉默TGSTransciptionalgenesilencing转录水平基因沉默3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA3-羟基-3-甲基戊二酰辅HMG-CoARreductase酶A还原酶CYP7alCholesterol7a^)hal-hydroxylase胆固醇7od-羟化酶腺苷三磷酸结合盒转运体ABCG5/8ATPbindingcassettetransportG5/G8G5和G8LXRLiverXreceptor肝脏X受体FXRFarnesoidXreceptor法尼醇X受体FoxOlForkheadtranscriptionfector叉头框转录因子?复旦大学

5、专业学位硕士论文中文摘要慢病毒介导RMA干扰技术制备骨桥蛋白基因沉默小鼠模型中文摘要第一部分靶向骨桥蛋白基因的shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定【摘要】目的构建针对骨桥蛋白（Osteopontin，OPN)基因的短发夹RNA(shorthaiipinRNA,shRNA)序列，合成pSicoR-GFP-shRNA慢病毒重组体，筛选对OPN基因表达抑制效率最佳的shRNA序列。方法参照OPNGeneBank上的序列设计合成shRNA-A，及不针对C57小鼠任何基因的阴性对照序列s_A-NC，参考相关文献合成针对骨桥蛋白基因的s_A-B。将合成的shRNA插入到线性化的pSicoR-GFP慢病毒

6、载体中；然后转染EcoliJM109感受态细胞，对长出的菌落进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性的克隆再进行测序。鉴定序列无误后，将之与pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91辅助质粒包装，然后共转染293FT细胞，进行慢病毒的包装及滴度测定，控制滴度在lxl09TU/m!以上。用构建好的慢病毒感染小鼠肝细胞，检测不同s_A序列对OPN基因表达的抑制效果，筛选最佳s_A序列。结果经RT-PCR禾卩Western-Blot检测发现:靶向OPN基因的shRNA慢病毒表达载体转染小鼠肝细胞后，序列shRNA-A/B均可有效抑制小鼠肝细胞OPN基因的表达，其中s_A-A序列效果最佳（可达80°/。-9

7、0%)。结论成功构建靶向OPN基因的shRNA慢病毒表达载体，其转染小鼠肝细胞后可显著抑制OPN基因的表达，这为进一步体内抑制试验奠定了基础。第二部分C57小鼠肝脏骨桥蛋白基因沉默动物模型的建立【摘要】目的将包装好的慢病毒经尾静脉注射到C57小鼠体内，抑制其肝脏骨桥蛋白（Osteopontin，OPN)基因的表达，建立OPN基因沉默小鼠动物模型。方法取30只C57小鼠随机平均分为：空白对照组（Blankcon