睾酮对小鼠卵泡体外发育影响及小鼠denndla基因慢病毒载体构建

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1、睾酮对小鼠卵泡体外发育影响及小鼠Denndla基因慢病毒载体构建第一部分辜酮对小鼠卵泡体外发育的影响前言多囊卵巢综合征(PCOS)影响着全球5-10%的青春期及育龄期女性，是最常见的妇科内分泌紊乱⑴。PCOS的临床表现多样性，常表现为月经不规律、多毛、痤掩、卵巢多囊样改变、糖耐量异常、肥胖等[2，3]。随着人们对于PCOS认识与研究的不断深入，多个PCOS的诊断标准被逐渐制定，但这些大都是针对外国妇女，2011年中国人在广泛调査并征求国内外专家意见后，由卫生部颁布了中国人自己的PCOS诊断标准，与之前不同的是此标准推荐应把PCOS患者进行分型，即根据有无高雄激素

2、和卵巢多囊样改变将PCOS分为经典和非经典型，而且前者代谢障碍表现较后者重[4]。毋庸置疑高雄激素是PCOS的重要特征之一[5]。人体内雄激素的浓度按照由高到低的顺序排列依次为：硫酸脱氧表雄酮（DHEAS)、脱氢表雄酮（DHEA)、雄炼二酮（A)、睾酮（T)、双氢睾酮(DHT)，但是人们认为前三者是雄激素的前体物质，在体内需要转化为睾酮才能发挥其生物学效应[6]，并且在人体内睾酮的雄激素活性最高，约为雄稀二酮的5-10倍，在临床上PCOS高雄激素血症的诊断主要依据血清总睾酮水平是否升高。循环血液中睾酮浓度的升高主要来自于卵巢产生的雄激素的增多，这也是PCOS妇女

3、的一个典型内分泌表型。虽然在不同人种中对于PCOS的诊断存在争议，但高雄激素血症和无排卵且不能用其他原因解释，是此疾病的特点，并且在所有达成共识的诊断标准中被作为一种关键性的组成部分。故本实验中利用小鼠卵泡体外培养模型，观察高浓度睾酮对卵泡发育的影响，以模拟高雄PCOS患者体内卵泡的发育过程。材料与方法1.实验动物本实验中使用的小鼠均为雌性ICR小鼠，由山东大学实验动物中心提供。卵泡培养使用的小鼠年龄为12日龄。2.实验药物(1)卵泡刺激素(FollicleStimulatingHormone,FSH)：丽珠公司，取75IUFSH溶于2mL氯化钠注射液中分装后-

4、20°C保存。(2)黄体生成素(LuteinizingHormone，LH)；MerckSeronoS.A公司，取75IULH溶于ImL氯化钠注射液中分装后-20°C保存。(3)睾酮(testosterone,T)：Sigma公司，称取0.865mg睾酮溶于3mL无水乙醇中，制成IxlO'3mol/L的睾酮母液，分装后-20°C保存。(4)氟他胺(flutamide，F)：Sigma公司，称取2.8mg氟他胺溶于1.4mLDMSO中，完全溶解后用滤器过滤，a-MEM定容至l0mL，制成氟他胺母液，分装后-20°C保存。结果

5、1.睾酮浓度蹄选(1)卵泡存活的标准：卵泡组织学形态清晰完整，卵母细胞周围有多层颗粒细胞包围；卵泡退化的标准：卵泡整体轮廓不规则、基底膜缺损或消失、卵母细胞游出或周围无颗粒细胞包围等。(2)每日观察卵泡生长情况可见Control组卵泡正常生长；10.4mol/LT组卵泡基底膜缺损或消失,颗粒细胞潤亡明显，卵泡生长受抑制卵泡基底膜清晰完整，与Control组相比卵母细胞周围颗粒细胞增殖明显，卵泡生长受到促进。培养第7天时lOAnol/LT组存活卵泡的数量与其余三组相比<0.01,差异有极显著性（图1;表1)。.2.高浓度睾酮对初级卵泡发育的影响Control

6、组卵泡在发育前期基底膜清晰完整，发育后期颗粒细胞增生明显；T组卵泡在发育前期即初级和次级卵泡阶段，卵泡增大明显，颗粒细胞增生明显，发育后期即窦状卵泡阶段，卵泡发育停滞、退化或死亡；F+T组卵泡生长趋势与Control组基本相同。：l(r5mol/LT组第14天存活卵泡数量与其余两组相比PO.Ol，差异有极显著性。（图2;表2)。在雌性哺乳动物，正常的卵泡发育经历以下几个阶段：原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡，最后排出成熟卵子，整个过程中卵泡正常的生长发育都受到机体精密的调节，多种激素和调节因子参与了调控过程。1959年Falck提出的两细胞-两促性腺素学说

7、，明确提出了FSH/LH的协同作用是卵泡正常发育和成熟的基础，随着研究的深入此理论逐渐成为卵巢生殖生理学和辅助生殖技术的理论基础和依据。女性进入青春期以后，卵泡的发育成熟幵始依赖于促性腺激素的刺激，性成熟期每月发育一批卵泡，一般只有一个优势卵泡可以完全成熟并排卵，其余卵泡在发育不同阶段通过细胞凋亡机制自行退化，称为卵泡闭锁。在初级卵泡阶段，颗粒细胞上开始出现FSH受体、雌激素受体和雄激素受体，卵泡内膜细胞出现LH受体，并具备合成性激素的能力，LH与其受体结合后，在卵泡膜细胞内胆固醇就可转化为雄激素，包括睾酮和雄稀二酮，并进入到颗粒细胞内，在FSH作用下，颗粒细胞

8、内的雄激素便可芳香化为雎