dpc4／smad4基因rna干扰靶点设计和慢病毒载体制备

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1、·1456·现代生物医学进展www~shengwuyixue．comProgressinModernBiomedicineVoLI4NO．8MAR．2014doi：10．13241／j．cnki．pmb．2014．08．015DPC4／Smad4基因RNA干扰靶点设计和慢病毒载体制备水仲丽丽周忠光△白云李洋张维嘉(1黑龙江中医药大学附属第一医院病理科黑龙江哈尔滨150040；2黑龙江中医药大学黑龙江哈尔滨150040；3哈尔滨市第一医院骨外科黑龙江哈尔滨150010)摘要目的：DPC4／Smad4基因RNA干扰靶点的设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备。方法：针对DPC4／Smad4基因

2、序列，并利用网站设计程序，依据RNA干扰序列设计的原则，设计多个RNA干扰靶点序列。根据设计经验和设计软件将其进行评估测定，选择最佳动力学参数靶点进入其后续的实验流程；生工生物合成含干扰序列的DNAoligo，具有严格的检测体系(PAGE纯化体系)。其两端含酶切位点粘端，直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细茵感受态细胞，并且对长出的克隆进行酶切鉴定。然后挑选出阳性克隆测序，进行测序比对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。将构建的慢病毒载体以及辅助包装载体质粒共转染到293T细胞。收获含有病毒的细胞培养上清，浓缩后进行滴度测定，并检测其

3、感染性。另外应用荧光实时定量PCR检测在感染的293T细胞中敲减效果。结果：成功构建DPC4／Smad4shRNA的慢病毒载体LVshSmad4，并成功制备DPC4／Smad4shRNA慢病毒，三株病毒感染细胞后均具有有效的敲减效应，其中SH1最为显著。结论：DPC4／Smad4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒制备，为以后探讨DPC4／Smad4基因与肿瘤的相关性治疗提供了实验基础。关键词：DPC4／Smad4；RNA干扰；慢病毒中图分类号：Q75，Q78文献标识码：A文章编号：1673—6273(2014)08-1456—04ConstructionandDesig

4、nofLentiviralshRNAtargetingDPC4／Smad4Gene水ZHONGLi-l．ZHOUZhong-guangca,BAIYune,LIYange,ZHANGWei-jia3《lPathologyDepartmentoftheFirstAffiliatedHospitalofHeilongfiangUniversityofChineseMedicine,Harbin,Heilongjiang,]5oo4~China；2HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin,Heilongjiang,15004~China；3

5、BoneSurgeryoftheFirstHospitalofHarbin,Harbin,Heilongjiang,15001~China)ABSTRACTObjective：ConstructionanddesignoflentiviralshRNAtargetingDPC4／Smad4gene．Methods：Web-basedprogramwasusedtoanalyzetheDPC4／Smad4sequencefortheshRNAtargetsitesanddesignRNAinterferencesequencewhichfitthedesigningprinciples．

6、Basedonthedesigningsoftwareevaluation，thesequenceswiththebestdynamicparameterswereselectedforsynthesisofDNAoligonucleotidewithsense-loop—antisensestructureandrestrictionenzymestickyends．DNAoligoswerePAGEpurifiedandinsert—edintotheshRNAlentiviralvectorcuredwithrestrictionenzymes．Theproductwastran

7、sformedintothecompetentcells．Theresultingbacterialcloneswerescreenedandidentifiedbytherestrictionenzymedigestionanalysis．Thepositiveconstructswerefurtherconfirmedbysequencing．TheresultinglentiviralconstructwereCO—transfected