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《dpc4/smad4基因rna干扰靶点设计和慢病毒载体制备》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、·1456·现代生物医学进展www~shengwuyixue.comProgressinModernBiomedicineVoLI4NO.8MAR.2014doi:10.13241/j.cnki.pmb.2014.08.015DPC4/Smad4基因RNA干扰靶点设计和慢病毒载体制备水仲丽丽周忠光△白云李洋张维嘉(1黑龙江中医药大学附属第一医院病理科黑龙江哈尔滨150040;2黑龙江中医药大学黑龙江哈尔滨150040;3哈尔滨市第一医院骨外科黑龙江哈尔滨150010)摘要目的:DPC4/Smad4基因RNA干扰靶点的设计和RNA干扰靶点慢病毒载体制备。方法:针对DPC4/Smad4基因
2、序列,并利用网站设计程序,依据RNA干扰序列设计的原则,设计多个RNA干扰靶点序列。根据设计经验和设计软件将其进行评估测定,选择最佳动力学参数靶点进入其后续的实验流程;生工生物合成含干扰序列的DNAoligo,具有严格的检测体系(PAGE纯化体系)。其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的细茵感受态细胞,并且对长出的克隆进行酶切鉴定。然后挑选出阳性克隆测序,进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。将构建的慢病毒载体以及辅助包装载体质粒共转染到293T细胞。收获含有病毒的细胞培养上清,浓缩后进行滴度测定,并检测其
3、感染性。另外应用荧光实时定量PCR检测在感染的293T细胞中敲减效果。结果:成功构建DPC4/Smad4shRNA的慢病毒载体LVshSmad4,并成功制备DPC4/Smad4shRNA慢病毒,三株病毒感染细胞后均具有有效的敲减效应,其中SH1最为显著。结论:DPC4/Smad4基因RNA干扰靶点的成功设计和RNA干扰靶点慢病毒制备,为以后探讨DPC4/Smad4基因与肿瘤的相关性治疗提供了实验基础。关键词:DPC4/Smad4;RNA干扰;慢病毒中图分类号:Q75,Q78文献标识码:A文章编号:1673—6273(2014)08-1456—04ConstructionandDesig
4、nofLentiviralshRNAtargetingDPC4/Smad4Gene水ZHONGLi-l.ZHOUZhong-guangca,BAIYune,LIYange,ZHANGWei-jia3《lPathologyDepartmentoftheFirstAffiliatedHospitalofHeilongfiangUniversityofChineseMedicine,Harbin,Heilongjiang,]5oo4~China;2HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin,Heilongjiang,15004~China;3
5、BoneSurgeryoftheFirstHospitalofHarbin,Harbin,Heilongjiang,15001~China)ABSTRACTObjective:ConstructionanddesignoflentiviralshRNAtargetingDPC4/Smad4gene.Methods:Web-basedprogramwasusedtoanalyzetheDPC4/Smad4sequencefortheshRNAtargetsitesanddesignRNAinterferencesequencewhichfitthedesigningprinciples.
6、Basedonthedesigningsoftwareevaluation,thesequenceswiththebestdynamicparameterswereselectedforsynthesisofDNAoligonucleotidewithsense-loop—antisensestructureandrestrictionenzymestickyends.DNAoligoswerePAGEpurifiedandinsert—edintotheshRNAlentiviralvectorcuredwithrestrictionenzymes.Theproductwastran
7、sformedintothecompetentcells.Theresultingbacterialcloneswerescreenedandidentifiedbytherestrictionenzymedigestionanalysis.Thepositiveconstructswerefurtherconfirmedbysequencing.TheresultinglentiviralconstructwereCO—transfected
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