人s100a6基因真核表达质粒的构建及rna干扰靶点筛选

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1、人S100A6基因真核表达质粒的构建及RNA干扰靶点筛选计：学位论文：47页表格：13个插图：22幅孟英爽指导教师：关宏伟教授申请学位级别：硕士学位专业名称：病理学与病理生理学论文提交日期：2012年4月论文答辩日期：2012年5月学位授予单位：大连医科大学学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在

2、论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：壶亟垄签字日期：型堡年』月一．22EI目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39四、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47人SIOOA6基因真核表达质粒的构建及RNA干扰靶点筛选硕士生姓名：孟英爽指导教师：关宏伟教授专业名称：病理学与病理生理学摘要研究背景：胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，化疗是进展期胃癌最重要的治疗措施，然而，由于肿瘤多药耐药(multidrugresistan

4、ce，MDR)的产生，常常导致化疗失败，因此，深入研究胃癌MDR形成的机制，从而采取RNA干扰、基因过表达等方法逆转胃癌MDR，将有可能给胃癌基因治疗带来新的突破。RNA干扰(RNAinterference，RINAi)是由双链RNA(doublestrandRNA。dsRNA)诱发的序列特异的转录后基因沉默(PTGS)过程。期间，双链RNA被特异的核酸酶降解成小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，小干扰RNA与靶蛋白结合成RNA诱导的沉默复合物(siRNA．inducedsilencingcomplex，RISC)，RISC识别并降解靶mRNA，产生有效的基因沉

5、默。l州A干扰技术具有相当高的特异性和高效性，并且操作简单、周期短、成本低。目前，该技术已成为研究基因功能、认识疾病本质的重要工具，将来更有望用于疾病的基因靶向治疗，具有相当广阔的临床应用前景。此前，本课题组以人胃癌细胞株SGC7901、阿霉素诱导的耐药细胞株SGC790l／ADR和丹参逆转后的耐药细胞株为研究对象，应用蛋白质组学技术对三者进行蛋白质组学的差异比较，并且通过高效液相色谱电喷雾电离飞行串联质谱对差异蛋白质进行鉴定，结果发现，S100A6在SGC7901中呈现高表达，在SGC7901／ADR中表达下调，在丹参逆转后的耐药细胞株中再次呈现高表达；并采用免疫细胞化学方法、Western

6、blot方法和RT．PCR技术再次验证了S100A6的差异表达。本研究以S100A6高表达的人胃癌细胞株SGC7901为研究对象，运用RNA干扰技术。将构建S100A6．shRNA质粒载体并转染入SGC7901细胞，筛选有效的RNA干扰片段，为有效下调S100A6在SGC7901细胞中的表达，并进一步探讨S100A6与胃癌MDR的关系奠定基础。目的：构建人S100A6基因shRNA真核表达质粒，利用实时荧光定量PCR技术检测其对S100A6基因的沉默效果，筛选出最有效的RNA干扰靶点，为进一步研究S100A6与胃癌多药耐药奠定基础。方法：本课题依据GeneBank中人S100A6基因序列，针对

7、S100A6基因设计合成具有高特异性的四条shRNA干扰片段，同时设计一无关序列作为阴性对照(negativecontrol，NC)。将各干扰片段及阴性对照与带有绿色荧光蛋白GFP及氨苄青霉素抗性的真核表达载体pRNAT．U6．1／GFP／Neo连接，阳性克隆鉴定及DNA测序鉴定重组质粒。用脂质体转染法将重组质粒转染到SGC7901细胞中，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况及转染效率。转染48