靶向bcl2基因短发卡rna干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立

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1、靶向bcl2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立：沈方臻林明刚肖文静王宁宁【摘要】目的构建针对bcl2基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体，转染到bcl2基因高表达的胃癌细胞株SGC7901中，并筛选出稳定低表达bcl2基因的细胞株。方法针对bcl2基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列，插入质粒载体pGPH1／GFP／Neo中，经脂质体介导转染SGC7901细胞。RTPCR检测bcl2基因在mRNA水平的变化,MTT法检测bcl2基因沉默后胃癌SGC7901细胞的增殖情况。基因沉默效果

2、最好的一组,经G418筛选以得到稳定表达株。结果与对照组相比，转染成功后的细胞bcl2基因在mRNA水平均显著下降，细胞增殖速度明显降低（t=2.41,P<0.05）;并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆。结论本研究成功利用针对bcl2基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl2基因的SGC7901细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础。【关键词】基因,bcl2；RNA干扰；质粒　　［ABSTRACT］ObjectiveToconstructashort,bcl2genetargetinghairpinRNA(sh

3、RNA)plasmidvector,ids.Thevectorsine.RTPCRployedtodetecttheproliferationoftumorcellsafterbcl2geneRNAexpressionofbcl2inthetransfectedcellsRNA,idvector.Thepresentstudyprovidedbasisforresearchongenetherapyofgastriccancer.［KEYTT)购自美国Sigma公司；上下游引物由上海生物工程有限公司合成。　　　1.2方法　　1.2.1靶

4、向bcl2基因shRNA表达载体的构建根据siRNA的设计原则及质粒载体pGPH1／GFP／Neo的特点，使用BLAST将选定的序列和相应的人基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列EST同源的序列，选择4条片段作为bcl2基因干扰片段并设计1条乱序非编码片段作为阴性对照，分别为：位于35～55bp的GGGAGATAGTGATGAAGTACA，位于354～372bp的GCTGCACCTGACGCCCTTC，位于435～455bp的GAGGATTGTGGCCTTCTTTGA，位于527～550bp的GGATGACTGAGTACCTGAAC

5、CGGC，阴性对照为GTTCTCCGAACGTGTCACGT,设计完成后送上海生物工程有限公司合成,得到重组质粒分别命名为pGPH1/GFP/Neobcl2shRNA1、pGPH1/GFP/Neobcl2shRNA2、pGPH1/GFP/Neobcl2shRNA3、pGPH1/GFP/Neobcl2shRNA4以及pGPH1/GFP/NeoshNC，经上海英骏生物技术有限公司进行测序,显示载体构建正确。　　1.2.2细胞培养及转染　　胃癌SGC7901细胞株置于含体积分数0.10胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、含体

6、积分数0.05CO2细胞培养箱中常规培养，取对数生长期细胞进行实验，以2.5g/L的胰酶消化传代。按照Lipofectamine2000说明书进行转染。实验分为阳性干扰组:转染特异性质粒pGPH1/GFP/Neobcl2shRNA1～4；阴性对照组:转染非特异性质粒pGPH1/GFP/NeoshNC；空白对照组:未转染质粒。　　1.2.3RTPCR检测bcl2mRNA的表达　　收集以上各组细胞，提取总RNA。取RNA5μL，合成cDNA，再PCR扩增。bcl2引物序列：P1(上游)5′GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG3

7、′,P2(下游)5′GGTGCCGGTTCAGGTACTCA3′,扩增产物长为116bp；同时选取GAPDH作为内参照,GADPH引物序列：P1(上游)5′CTGCACCACCAACTGCTTAG3′,P2(下游)5′TGAAGTCAGAGGAGACCACC3′,扩增片段长度为407bp。PCR反应参数：94℃变性4min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，33个循环；72℃延伸7min。于15g/L的TAE琼脂糖凝胶上电泳检测，目的条带采用凝胶成像分析系统分析，测定各条带的灰度值，以bcl2与GAPDH条带灰度值

8、的比值作为bcl2mRNA的相对表达水平。bcl2mRNA表达的抑制率=(1-实验组bcl2mRNA相对表达水平)／空白对照组bcl2mRNA相对表达水平×