靶向bcl2基因短发卡rna干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立论文

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1、靶向bcl2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立论文沈方臻林明刚肖文静王宁宁【摘要】目的构建针对bcl2基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体，转染到bcl2基因高表达的胃癌细胞株SGC7901中，并筛选出稳定低表达bcl2基因的细胞株。方法针对bcl2基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列，插入质粒载体pGPH1／GFP／Neo中，经脂质体介导转染SGC7901细胞。RTPCR检测bcl2基因在mRNA水平的变化,MTT法检测bcl2基因沉默后胃癌SGC7901细胞的增殖情况。基因沉默效果最好

2、的一组,经G418筛选以得到稳定表达株。结果与对照组相比，转染成功后的细胞bcl2基因在mRNA水平均显著下降，细胞增殖速度明显降低（t=2.41,P0.05）;并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆。结论本研究成功利用针对bcl2基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl2基因的SGC7901细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础。【关键词】基因,bcl2；RNA干扰；质粒［ABSTRACT］ObjectiveToconstructashort,bcl2genetargetinghairpinRNA(shRNA)plasmid

3、vector,ids.Thevectorsine.RTPCRployedtodetecttheproliferationoftumorcellsafterbcl2geneRNAexpressionofbcl2inthetransfectedcellsRNA,idvector.Thepresentstudyprovidedbasisforresearchongenetherapyofgastriccancer.［KEYTT)购自美国Sigma公司；上下游引物由上海生物工程有限公司合成。1.2方法1.2.1靶向bcl2基因shRNA表达载体的构

4、建根据siRNA的设计原则及质粒载体pGPH1／GFP／Neo的特点，使用BLAST将选定的序列和相应的人基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列EST同源的序列，选择4条片段作为bcl2基因干扰片段并设计1条乱序非编码片段作为阴性对照，分别为：位于35～55bp的GGGAGATAGTGATGAAGTACA，位于354～372bp的GCTGCACCTGACGCCCTTC，位于435～455bp的GAGGATTGTGGCCTTCTTTGA，位于527～550bp的GGATGACTGAGTACCTGAACCGGC，阴性对照为GTTCTCCGAACG

5、TGTCACGT,设计完成后送上海生物工程有限公司合成,得到重组质粒分别命名为pGPH1/GFP/Neobcl2shRNA1、pGPH1/GFP/Neobcl2shRNA2、pGPH1/GFP/Neobcl2shRNA3、pGPH1/GFP/Neobcl2shRNA4以及pGPH1/GFP/NeoshNC，经上海英骏生物技术有限公司进行测序,显示载体构建正确。1.2.2细胞培养及转染胃癌SGC7901细胞株置于含体积分数0.10胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、含体积分数0.05CO2细胞培养箱中常规培养，取对数生长期细胞

6、进行实验，以2.5g/L的胰酶消化传代。按照Lipofectamine2000说明书进行转染。实验分为阳性干扰组:转染特异性质粒pGPH1/GFP/Neobcl2shRNA1～4；阴性对照组:转染非特异性质粒pGPH1/GFP/NeoshNC；空白对照组:未转染质粒。1.2.3RTPCR检测bcl2mRNA的表达收集以上各组细胞，提取总RNA。取RNA5μL，合成cDNA，再PCR扩增。bcl2引物序列：P1(上游)5′GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG3′,P2(下游)5′GGTGCCGGTTCAGGTACTCA3′,扩

7、增产物长为116bp；同时选取GAPDH作为内参照,GADPH引物序列：P1(上游)5′CTGCACCACCAACTGCTTAG3′,P2(下游)5′TGAAGTCAGAGGAGACCACC3′,扩增片段长度为407bp。PCR反应参数：94℃变性4min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，33个循环；72℃延伸7min。于15g/L的TAE琼脂糖凝胶上电泳检测，目的条带采用凝胶成像分析系统分析，测定各条带的灰度值，以bcl2与GAPDH条带灰度值的比值作为bcl2mRNA的相对表达水平。bcl2mRNA表达的抑制率=(

8、1-实验组bcl2mRNA相对表达水平)／空白对照组bcl2mRNA相对表达水平×100％。1.2.4MTT法检测bc