rna干扰靶向抑制胃癌sgc7901细胞cox2基因和蛋白表达的研究论文

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1、RNA干扰靶向抑制胃癌SGC7901细胞COX2基因和蛋白表达的研究论文李玉明蒋宏吴峰阶于兴泉宋丙潭刘春远【摘要】目的利用RNAi技术,以胃癌SGC7901细胞COX2作为靶点,建立有效的RNA干扰方法,为胃癌及其复发和转移提供基因治疗的新方法。方法设计并合成6条COX2siRNA和1条阴性对照siRNA,用3种不同的转染试剂分别转染胃癌SGC7901细胞,荧光定量PCR和ethodsSixpiecesofCOX2smallinterferenceRNA(siRNA)andonenegativecontrolsiRNAica

2、lly,gastriccancercelllineSGC7901mediatedbythreedifferenttransfectionreagent.COX2mRNAandCOX2proteinofgastriccancercelllineSGC7901equantitativePCRandEM稀释至50μl,在室温下放置5min,0.8μg的pcDNA/lacZ、siRNA或DNA/siRNA用optiMEM稀释至50μl,将上述稀释液混匀,在室温下放置30min;加入培养基中,振板摇匀。24~72h后检测基因表达情况。

3、1.2.4荧光定量PCRCOX2上游引物5’GAATCATTCACCAGGCAAATTG3’,COX2下游引物5’TCTGTACTGCGGGTGGAACA3’,COX2探针5’FAMTGGCAGGGTTGCTGGTGGTAGGATAMRA3’。将SGC7901细胞中克隆的COX2基因克隆到pMD18TVector上,在大肠杆菌中扩增,提取重组的pMD18TCOX2质粒,经岛津分光光度计检测,确定含有COX2基因的重组质粒的浓度,并确定每微升DNA溶液中的拷贝数,做为标准品。使用RealTimeR

4、TPCR试剂盒,RT反应体系为:MgCl22μl、10×RT缓冲液1μl、dNTP(各10mM)1μl、RNaseinhibitor0.25μl、AMVReverseTranscriptase0.5μl、RandomPrimer0.5μl、RNA模板1μg、补水至10μl。RT反应条件:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。PCR反应体系2×RealTimeRTPCRMix12.5μl,上述RT反应产物10μl,补水至25μl。PCR条件:94℃3min,94℃30s,57℃30s,72℃45s,4

5、0个循环。使用自动PCR仪检测。1.2.5arker(1∶1000)。结果用凝胶图像成像及化学发光系统分析,测定信号条带的吸光度值。将已发光的膜洗脱后,重新孵育另一个抗体(兔源性GAPDHⅠ抗1∶500)作内参照,步骤同上。最后用目的蛋白值/内参照蛋白值的比值作为该蛋白的相对含量。2结果2.1转染方法的建立用三种转染试剂分别以报告基因pcDNA3.1/His/lacZ转染胃癌SGC7901细胞,结果发现:TOPeasy不能够有效介导DNA(pcDNA/lacZ)转染SGC7901细胞(图1);lipofectamin2000可以介

6、导DNA(pcDNA/lacZ)转染SGC7901细胞,但作用微弱(图2),细胞转染率为10.2%;TOPtranfection能够有效介导DNA(pcDNA/lacZ)转染SGC7901细胞(图3),细胞转染率为56.0%;lipofectamin2000可以介导DNA(pcDNA/lacZ)和siRNA转染SGC7901细胞,但抑制效果不明显(图4);TOPtransfection能够有效介导DNA(pcDNA/lacZ)和siRNA共转染SCG7901细胞,并敲低lacZ基因的表达(图5)。2.2荧光定量PCR在24孔板上接

7、种SGC7901细胞,在次日细胞密度达到70%~80%。TOPtranfection2.0μl用optiMEM稀释至50μl,在室温下放置5min;COX2siRNA(0~5号)及阴性对照siRNA各0.4μg分别用optiMEM稀释至50μl;将上述两种稀释液混匀,在室温下放置30min;加入培养基中,振板摇匀。24h后检测COX2基因表达情况,结果见表2。表2siRNA转染后COX2mRNA拷贝数2.3COX2蛋白表达情况收集经COX20siRNA及阴性对照siRNA转染的胃癌细胞1×107,用BCR/ABL融

8、合基因特异的siRNA转染K562细胞,发现K562细胞中相应的mRNA被清除,并出现强烈的细胞凋亡现象。Ning等[8]发现抗凋亡蛋白survivin对癌细胞有上调作用,并且可能有防止膀胱癌细胞凋亡的作用,他们通过siRNA介导的survivin

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