rna干扰技术抑制ec109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究

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1、RNA干扰技术抑制EC109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究【摘要】目的：应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对survivin基因的siRNA，抑制survivin基因的表达并诱导食管癌细胞系EC109细胞的凋亡.方法：构建针对survivin的siRNA表达质粒，转染至EC109细胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质印迹和半定量RTPCR检测survivin蛋白表达及基因转录水平的变化，并在不同时间点收集转染细胞，利用流式细胞术及基因组DNA凋亡检测试剂盒，观察siRNA抑制survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况.结果：荧光显微镜结果表明

2、，重组质粒转染效率达46.70％.半定量RTPCR检测到pSIREN/S质粒在EC109细胞内对survivin基因的转录抑制率为74.04%；蛋白质印迹结果表明，转染重组质粒pSIREN/S的EC109细胞survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64%，而对照质粒pSIREN/对survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用.经pSIREN/S转染的EC109细胞基因组DNA出现明显的DNAladder，流式细胞仪分析结果也显示凋亡细胞为60.78%.结论：survivin特异性siRNA可明显抑制survivin基因的转录和表达，并能有效地诱导

3、EC109细胞的凋亡，为下一步在体内利用pSIREN/S重组质粒沉寂survivin基因，促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础.【关键词】RNA干扰技术食管肿瘤survivin基因EC109细胞　　0引言　　潮汕地区是中国六大食管癌高发区之一，据统计，广东省南澳县恶性肿瘤死因构成的排位顺序为食管癌最高，占恶性肿瘤死亡总数的半数以上［1］.因此对于食管癌特别是中晚期患者，寻找有效的治疗手段至关重要.survivin是IAP（inhibiteapoptosisprotein）家族成员之一，具有抑制凋亡的作用；同时也是细胞周期调节蛋白，通过干扰细胞的有丝分裂以调节细胞的凋亡

4、［2］.已有文献［3-5］报道，食管癌患者的肿瘤组织中survivin的表达明显高于正常组织，我们利用siRNA技术，以食管癌EC109细胞株为模型，利用survivin特异性siRNA，对survivin基因的转录、表达及其诱导EC109细胞凋亡进行了研究.　　1材料和方法　　1.1材料　　人食管鳞癌细胞株EC109为汕大医学院沈忠英教授馈赠.大肠杆菌DH5α及RNAi载体质粒RNAiReadypSIRENDNRDsRedExpression购自Invitrogen公司.RPMI1640、小牛血清、胰蛋白酶等购自Sigma公司.脂质体Lipof

5、ectamine2000购自Invitrogen公司.兔抗人survivin单抗购自SantaCruze，CY3标记的羊抗兔IgGFc抗体购自武汉博士德公司.限制性核酸内切酶EcoRI，BamHI等购自NEB公司.T4DNA连接酶、DL2000标准Marker由TaKaRa公司提供.质粒提取试剂盒购自上海博光生物技术有限公司.RNaeasyKit购自Qiagen公司.　　1.2方法　　1.2.1抑survivinsiRNA序列及载体构建　　根据survivin的编码序列及以往的研究资料，结合siRNA序列设计原则并利用Blast进行查询，确定其为特异性survi

6、vinRNA干扰的靶序列,其正义链:5′gatccaaagcattcgggttgcttcaagacggcaaccggacgaatgctttttttttgaattca3′,反义链:3′agcttgaattcaaaaaaaaagcattcgtccggttgccgtcttcaagcaaccggacgaatgctttg5′.为排除siRNA本身的影响，我们设计了无关的siRNA序列，序列，即正义链为：5′gatccgacttcataaggcgcatgcttcaagacggcatgcgccttatgaagtcttttttgtcgaca3′，反义链为：3′gctgaag

7、tattccgcgtacgaagttctgccgtacgcggaatacttcagaaaaaacagctgttcga5′.所有的寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.退火后分别插入经BamHI和EcoRI线性化的载体pSIREN中，构建重组载体pSIREN/S和pSIREN/.转化大肠杆菌DH5α，挑取氨苄青霉素抗性菌落并扩增培养，然后快速小量制备质粒并进行核酸测序鉴定，选择序列正确的克隆扩大培养.　　1.2.2细胞培养与转染EC109细胞株常规培养于　　RPMI1640培养基中，每2～3d经2.5g/L的胰酶消化，传代培养.采用Lipofect

8、amine