rna干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性影响

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1、第1章材料与方法1．1材料1．1．1主要试剂与仪器标准胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司RPMI1640培养基美国Gibco公司磷酸盐缓冲液北京中杉金桥生物技术有限公司胃蛋白酶(1：30)北京中杉金桥生物技术有限公司胰蛋白酶(1：100)北京中杉金桥生物技术有限公司Lipofectamine2000转染试剂盒Invitrogen公司OPTI—MEMI优化培养基Invitrogen公司四甲基偶氮唑蓝(MTT)Sigma公司Trizol试剂Invitrogen公司细胞周期与凋亡检测试剂盒碧云天RT—PCR试剂盒大连宝生生物工程有限公司小分子量蛋白MarkerGalen公司二氧化碳培养箱美国T

2、hermoElectronCorporation公司液氮罐美国ThermoElectronCorporation公司电子分析天平(卧式，BP3100S)SartoriusBasicplus，Germany高速离心机上海医用仪器生产厂恒温磁力搅拌器Heidolph，Germany细胞培养瓶美国Corning公司倒置显微镜0LYMPUS公司恒温水浴箱北京医疗设备厂台式微称量天平上海天平仪器厂BTY-S．D．1000KT型超净工作台国家海洋局第一海洋研究所高压消毒柜MicromseriesSA一300凝胶成像系统KodakEDAS290酶标检测仪BIO-RAD流式细胞仪(B．D．Vantage型)

3、Becton—DiksonFACSVantageUSAPCR扩增仪美国RE公司2ul，10

4、l1，200ul，1000u121：I样枪LabsystemsFinland1青岛大学硕士学位论文1．1．2细胞株人肝癌细胞株HepG2由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供，在RPMI1640培养液(含体积分数为0．10胎牛血清)中培养，置于37。C体积分数为0．05的C0：温箱中，每2-3天传代一次，选用处于对数生长期的肝癌细胞开始实验。1．2方法1．2。1重组质粒的构建根据RNA设计原则及survivin基因(NM一001168)编码序列，利用BLAST进行查询，并以前期实验结果为依据畸1，特异

5、性的合成1对针对survivin编码序列的siRNA片段，并构建survivin基因的重组载体pshRNA—survivin一387，基因靶点位于survivin基因序列第387位点，靶基因序列为5’一GAAAGTGCGCCGTGCCATC一3’。重组载体两端设有BarnHI或Bbs工酶切位点，以利于与pGPHl／GFP／Neo载体连接。按照实验设计，由上海吉玛公司构建合成阴性对照表达载体pshRNA—survivin—NC及阳性对照表达载体pshRNA-survivin-GAPDH。三种重组质粒包含绿色荧光蛋白的表达框架，转入细胞后可表达绿色荧光蛋白，用荧光显微镜可确定转染效率。图1pGP

6、HI／GFP／Neo载体绪构1．2．2细胞分组和转染4第1章材料与方法转染前24h，取处于对数生长期的HepG2细胞，传代接种于6孔板，2ml无抗完全培养基，使细胞数约5×105个／每孔，培养于37。C、含体积分数0．05C02培养箱中，转染时细胞融合度达到70"--'90％。分别设置空白对照组(不加液体)、阴性对照组(每孔加pshRNA—survivin—NC4ug)、siRNA转染组(每孑LJJnpshRNA-survivin一3874ug)。每组各设5个复孔，转染过程按Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行。质粒(ug)与脂质体(u1)的比例为l：2．5。转染后将细胞板

7、置于培养箱中培养，孵育4—6h后除去复合物，更换培养基，转染24-48h后于荧光显微镜下计算转染效率。1．2．3RT-PCR技术检测surviVinmRNA水平转染48h后分别收集3组细胞，调整细胞浓度为107／L，采用TrizoL法提取总RNA。RT反应体系为20uL(包括提取的RNA2uL，PrimescriptRTaseluL、OligodTlul、dNTPlul和适量5*RTbuffer、氯化镁)，混匀，于PCR仪上行RT反应，反应条件：42℃60min，95℃5min，终止反应合成eDNA。PCR扩增体系为50uL，反应条件：94。C变性30s，55。C退火45s，72"(2延伸1

8、min，共35个循环。取PCR产物，在含EB的20g／L的琼脂糖凝胶中电泳分离后，以凝胶成像系统分析结果。PCR扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上游引物序列：5’一TCAAGGACCAcCG—CATCTCTA一3’，下游引物序列：5’一CCAGCTCCTT—GAAGCAGAAGAA一3’。以GAPDH作为内参照。应用分析软件进行相对定量分析，survivinmRNA水平以survivin产物量