RNA体外干扰肝癌Hep3B细胞VEGF基因的表达

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1、RNA体外干扰肝癌Hep3B细胞VEGF基因的表达作者：蒋冬贵　夏昆　刘劫　罗红　潘乾　龙志高　夏家辉【摘要】目的：通过自主构建的RNAi载体和体外合成siRNA的方法，寻找能有效干扰VEGF基因表达的载体和siRNA片段治疗肿瘤.方法：将自主构建的pcDUVEGF1和pcDUVEGF2，以及体外合成的TWvegf1和TWvegf2siRNA片段转染肝癌Hep3B细胞，通过RTPCR,WesternBlot和ELISA检测转染前后VEGF的mRNA及蛋白表达水平,以了解RNA干扰效果.结果：两种RNA干

2、扰的方法均能抑制VEGF基因的表达且差异具有显著性（mRNA,0.28，0.47，0.76，0.58vs1.2,P<0.01;蛋白质,138,121,249,227vs389μg/L,P<0.01）.结论：两个质粒及siRNA片段均能有效的抑制VEGF基因的表达.【关键词】RNAi；siRNA；血管内皮生长因子；肝癌细胞　　　　【Abstract】AIM:ToconstructRNAiplasmidsandsynthesizesiRNAinvitro,transportthemintoHep3Bcel

3、ls,soastofindsomeeffectiveVEGFRNAiplasmidsandsiRNAsegments.METHODS:TheRNAiplasmidspcDUVEGF1,pcDUVEGF2andsiRNAsegmentsTWvegf1,TWvegf2weretransportedintoHep3Bcells,andtheexpressionsofVEGFmRNAandproteininthe8transfectedHep3BcellswerecheckedusingRTPCR,West

4、ernBlotandELISA.TheresultswerecomparedbetweenthetransfectedandthenormalHep3Bcells.RESULTS:TherewereprominentdifferencesbetweenthetwogroupsindepressingtheexpressionofmRNA(0.28,0.47,0.76,0.58vs1.2,P<0.01)andprotein(138,121,249,227vs389μg/L,P<0.01)ofVEGFge

5、ne.CONCLUSION:ThetwoRNAiplasmidsandsiRNAsegmentsinhibittheexpressionofVEGFgeneeffectively.　　【Keywords】RNAi;siRNA;VEGF;hepatocarcinoma　　0引言　　VEGF/VEGFR系统在恶性肿瘤中的协同表达，旁/自分泌作用机制的确立为肿瘤的临床治疗提供了新的靶点.在哺乳动物的细胞种发夹结构的双链RNA被剪切成siRNA，在体内组装成蛋白复合体，在siRNA的引导下Dicer酶切割靶RNA，或者以靶

6、RNA为模板合成新的双链RNA，进一步被Dicer识别和剪切,21ntsiRNA在哺乳动物细胞中可以诱导强有力的特异性RNAi作用［1-4］.我们使用自主构建的RNAi真核基因表达载体pcDU6选择特异的VEGF基因片段构建VEGF基因的RNAi质粒，选择特异的VEGF基因片段体外合成21ntsiRNA，并将它们脂转入肝癌Hep3B细胞后，通过RTPCR,WesternBlot和ELISA的方法检测它们对VEGFmRNA和蛋白表达的抑制作用，以期找到可靠的抑制VEGF基因表达的质粒和siRNA片段，为肝癌的基因

7、治疗提供一种新的方法.8　　1材料和方法　　1.1材料　　设计合成两段人U6promoter315至+1的PCR寡核苷酸引物从人的gDNA中扩增出U6promoter（5′端增加BglII，3′增加ApaI的酶切位点）.将PCR产物用BglII和ApaI双酶切后,再将pcDNA3.1(-)质粒用BglII和ApaI双酶切，构建成RNAi质粒pcDU6，构建pcDU6的引物序列为正向：5′gcagatctacgcgcaggcaaaacgcacc,反向:5′ttgggcccggtgtttcgtcctttccac.根据

8、高效RNAi基因片段的设计原则［2］，我们设计并从上海博亚生物制品有限公司申请合成了构建VEGF基因RNAi载体的寡核苷酸片段以及体外合成针对VEGF基因的siRNA的寡核苷酸片段，肝癌Hep3B细胞株购自CCTCC，非必需氨基酸（NAA）、丙酮酸钠、胎牛血清、胰酶、EDTA,G418均购自Gibcol公司，RPMI1640干粉培养基购自Hyclone公司