rna干扰技术抑制ec109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究论文

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1、RNA干扰技术抑制EC109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究论文【摘要】目的：应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对survivin基因的siRNA，抑制survivin基因的表达并诱导食管癌细胞系EC109细胞的凋亡.方法：构建针对survivin的siRNA表达质粒，转染至EC109细胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质印迹和半定量RTPCR检测survivin蛋白表达及基因转录水平的变化，并在不同时间点收集转染细胞，利用流式细胞术及基因组DNA凋亡检测试剂盒，观察siRNA抑制survivin基因表

2、达后诱导细胞凋亡的情况.结果：荧光显微镜结果表明.freela公司.脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司.兔抗人survivin单抗购自SantaCruze，CY3标记的羊抗兔IgGFc抗体购自武汉博士德公司.限制性核酸内切酶EcoRI，BamHI等购自NEB公司.T4DNA连接酶、DL2000标准Marker由TaKaRa公司提供.质粒提取试剂盒购自上海博光生物技术有限公司.RNaeasyKit购自Qiagen公司.1.2方法1.2.1抑survivinsiRNA序列及载体构建根据su

3、rvivin的编码序列及以往的研究资料，结合siRNA序列设计原则并利用Blast进行查询，确定其为特异性survivinRNA干扰的靶序列,其正义链:5′gatccaaagcattcgggttgcttcaagacggcaaccggacgaatgctttttttttgaattca3′,反义链:3′agcttgaattcaaaaaaaaagcattcgtccggttgccgtcttcaagcaaccggacgaatgctttg5′.为排除siRNA本身的影响，我们设计了无关的siRNA序列，序列，即正义链为：5′gatc

4、cgacttcataaggcgcatgcttcaagacggcatgcgccttatgaagtcttttttgtcgaca3′，反义链为：3′gctgaagtattccgcgtacgaagttctgccgtacgcggaatacttcagaaaaaacagctgttcga5′.所有的寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.退火后分别插入经BamHI和EcoRI线性化的载体pSIREN中，构建重组载体pSIREN/S和pSIREN/.转化大肠杆菌DH5α，挑取氨苄青霉素抗性菌落并扩增培养，然后快速小量制

5、备质粒并进行核酸测序鉴定，选择序列正确的克隆扩大培养.1.2.2细胞培养与转染EC109细胞株常规培养于RPMI1640培养基中，每2～3d经2.5g/L的胰酶消化，传代培养.采用LipofectamineTM2000(Invitrogen)脂质体转染法转染，操作流程按照说明书进行.将正常培养的EC109细胞用胰酶消化，1000r/min离心5min，以2×108个细胞/L重悬于培养基，2mL/孔接种于六孔板中，待细胞生长密度约为70%～80%时，更换无血清、无抗生素培养基.实验分为三组，即pSIREN/S,pSIRE

6、N/和未转染对照组.转染后6h更换正常培养基，12h后在荧光显微镜与流式细胞仪下观察DsRed的表达，推测转染效率.1.2.3半定量RTPCR检测EC109细胞survivinmRNA的表达分别于转染后24，36，48，72和96h收集pSIREN/S细胞及pSIREN/和未转染对照组细胞各2×106个，PBS洗涤两遍，提取各组细胞总RNA.逆转录引物采用Uni12和PolyT进行，在RTPCR反应体系中加入二对引物，第一对是内源对照GAPDH(336~1235bp)，5′cgaaggtgaaggtcggagtc

7、3′和5′gaccacctggtgctcagtgt3′，第二对是被沉寂的目的基因的引物，即survivin(991~1500bp)，5′atagtcgacatgggtgccccgacgttg3′和5′ctcggatcctcaatccatggcagccag3′.扩增片段为509bp.具体操作过程参照逆转录试剂盒说明书.利用GeneTools软件测定GAPDH及survivin的A值，结果以其和内参照GAPDH的A值来反映其相对含量，确定survivin基因在不同时间点被siRNA沉寂的程度.1.2.4免疫荧光染

8、色生长在盖玻片上的细胞用40g/L多聚甲醛室温下固定20min，0.5g/L胰酶、30mL/L过氧化氢(甲醇配制)各处理30min后，正常羊血清封闭30min.加入一抗（兔抗人survivin，SantaCruze,1∶200）4℃湿盒过夜，PBST漂洗后，加入二抗（Cy3标记的羊抗兔IgG，博士德，1∶100），