rna干扰技术抑制宫颈癌hela细胞tpx2基因表达的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文RNA干扰技术抑制宫颈癌Hela细胞TPX2基因表达的研究姓名：勾晓娟申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：程建新201203中文摘要RNA干扰技术抑制宫颈癌Hela细胞TPX2基因表达的研究摘要目的：TPX2(targetingproteinforXklp2)是一个严格受细胞周期调控的核增殖蛋白，对细胞有丝分裂纺锤体的稳定具有重要作用。体内外实验均表明TPX2过表达导致细胞中心体的异常扩增及异倍体形成，进而促进细胞增殖、诱导凋亡、参与细胞周期调节，并与肿瘤分化、转移和复发明显相关。本实验研究针对靶基因TPX2的特

2、异性小干扰RNA(smallRNAinterference，siRNA)对宫颈癌Hela细胞株TPX2基因和蛋白表达的抑制作用，为宫颈癌的靶向基因治疗提供了实验基础和理论依据。方法：以宫颈癌Hela细胞为研究对象，按照siRNA的设计原则设计4对针对TPX2基因的siRNA(分别命名TPX2一siRNA．1、TPX2．siRNA-2、TPX2一siRNA．3和TPX2一siRNA．4)和l对不针对任何靶基因的非特异性阴性对照siRNA(命名为TPX2．siRNA．Neg)。MTT法分别检测Lipofectamine2000和阴性siRNA两种

3、转染试剂的细胞毒性，根据细胞毒性试验结果，将¨pofectamine2000和阴性siRNA以不同配比转染Hela细胞，转染后4h和24h分别应用流式细胞仪和荧光显微镜评估转染率，从而筛选出最佳转染条件。利用Lipofectamine2000脂质体法将设计合成的TPX2一siRNA转染入宫颈癌Hela细胞中进行后续实验，观察siRNA沉默TPX2基因的效果和蛋白表达的抑制情况。本实验共分6组：Hela空白对照组、TPX2一siRNA一1、TPX2一siRNA一2、TPX2．siRNA一3、TPX2．siRNA一4及阴性对照组(TPX2一siR

4、NA—Neg)。转染24小时后提取各组细胞总RNA，以RT-PCR方法检测转染后Hela细胞株TPX2mRNA的变化。转染48小时后提取各组细胞的总蛋白，以WesternBlotting法检测转染后TPX2蛋白表达情况，计算蛋白表达抑制率。采用SPSS13．0软件对实验结果进行统计分析。统计数据以均数土标准差来表示，t检验和方差分析用来比较两样本及多样本分析，显著性差异水平为0c=O．05。结果：1、阴性siRNA分别以0．251al、0．59l、0．759l、1“l、1．259l及1．5“l的用量转染1×104个Hela细胞后其细胞存活率均

5、在95％上，随着时间的中文摘要延长，在转染24h、48h、72h及96h后细胞存活率无统计学意义(P>O．05)。Lipofectamine2000以1．25I，tl和1．5“l转染1×104个Hela细胞24h后细胞存活率分别为90-32％和89．39％，且随时间的延长细胞存活率随之降低，与O．25}tl、O．5“l、0．75Irtl及1“l组相比具有统计学意义(P

6、1．53)％。3、实验组4种TPX2一siRNA转染后均发挥TPX2基因沉默效应，尤以TPX2．siRNA．4效果最明显，其TPX2的相对含量为0．089士0．008与空白对照组0．507土0．056及阴性对照组O．463+0．115相比有统计学意义(P<0．05)，TPX2基因沉默效率为(82．5+0．43)％。4、TPX2一siRNA．4的蛋白表达水平明显降低，蛋白相对含量为0．298i0．072，与空白对照组0．814+0．085及阴性对照组0．809士0．055相比均有统计学意义(P<0．05)，TPX2蛋白抑制率达(63．4+1．0

7、5)％。结论：TPX2．siRNA成功转染入宫颈癌Hela细胞后能特异性诱导TPX2基因mRNA的降解，抑制TPX2蛋白水平的表达，这为进一步研究其对Hela细胞生物学特性的影响奠定了基础。关键词：siRNA；转染；TPX2；宫颈癌；Hela细胞株：RT-PCR：WesternBlotting；MTT英文摘要————_--—___-———______—__————'__-__●——-——_———●●_——————●——__●__-—————————●-—————————————————————一⋯StudyofsiRNAsilencingTP

8、X2geneinHelacelllineofhumancervicalcancerABSTRACTObjective：TPX2targetprotein(targe