rna干扰抑制宫颈癌caski细胞株中il-8基因表达的研究

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1、山两仄丰}人掌坝l7n【^正RNA干扰抑制宫颈癌CaS瞄细胞株中IL．8基因表达的研究中文摘要宫颈癌(cervicalcancer．CC)是鼓常见的§j科恶件肿瘤之．其发生率居全球第，f≯，我罔是宫颈癌的高发国家，近年来发病有明显年轻化趋势，严重威胁着女性的健康和生命。IL．8是与炎症相关的多功能趋化因子，不仅可以诱导肿瘤血管生成，还可促进肿瘤细胞的增隹和迁移。已有研究表明IL一8与多种肿瘤(如宫颈癌，乳腺癌、卵巢癌、胃癌等)的浸润，转移、临床分期及预后密切相关。本课题组前期对早期宫颈鳞癌(SquamousCervicalCarcinoma，SCC)进行了eDN

2、A基因芯片筛查，结果表明IL一8在有淋巴结转移宫颈瘟组织中的表达较无淋巴结转移宫颈癌组织高3．4倍，并经体外实验证明IL一8可通过促进宫颈癌细胞的增生，迁移、与内皮细胞的黏附作用及促进宫颈癌的血管生成等机制提高宫颈癌的浸润转移能力⋯。RNA干扰(RNAinterfeFence，RNAi)是新发展起来的抑制基因表达的有效方法，本课题通过构建lL一8小发央状RNA(shorthairpinRNA，shRNA)真核表达载体，探讨其能否抑制宫颈癌CaSki细胞株中IL．8基因表达，以及对宫颈癌细胞生物学行为的影响，探索RNA干扰技术作为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。目的

3、：构建经EGFP绿色荧光标记的IL-SshRNA真核表达载体，探讨其对宫颈癌CaSki细胞株中IL．8基因和蛋白表达的抑制效果，以及其对宫颈癌细胞增生、趋化运动的抑制作用。方法：首先，根据Genbank中报道的IL．8eDNA序列合成2对IL一8shRNA对应RNAi作用靶点的寡核苷酸序列及l对阴性对照序列，并将其定向克隆入真核表达载体PGenesil—l中。其次，利用脂质体将经荧光标记的IL．8shRNA真核表达载体转染入宫颈癌CaSki细胞株中，以荧光显微镜观察其转染效率，以RT-PCR方法检测转染前后IL一8mRNA的变化，以ELISA和免疫细胞化学法检测

4、转染前后IL．8蛋白表达情况。最后，应用MTT法、集落形成实验以及Boyden小室法检测转染前后各组增殖和趋化运动有何差异。结果：经酶切鉴定及DNA序列测定证实IL一8shRNA真核表达载体己成功构建。利用脂质体转染经荧光标记的IL一8shRNA真核表达载体，瞬时转染72h小时倒置显微镜观察发现各组转染IL．8shRNA表达质粒对细胞形态及生长状态无明显影响。72小时经多视野阳性细胞计数计算CaSki细胞的转基因效率约为60．37％=1=0．68％。RT-PCR检测IL一8shRNAl与IL．8shRNA2对IL．8mRNA的抑制率分别为63．90％和71．14

5、％，ELISA检测结果表明IL-8shRNAl与IL一8shRNA2对lL．8蛋白表达的抑制率分别为60．80％和72．13％，与RT-PCR结果基本一致，且IL一8shRNA2抑制作用更为有效。用抑制效果好的IL一8shRNA2质粒转染CaSki细胞进行免疫细胞化学检测，结果表明IL一8呈弱阳性表达，而转染阴性对照质粒和空白对照的CaSki细胞IL．8呈强阳性表达。MTT法、集落形成实验以及Boyden小室山阳仄‘f人学坳lJ掌位论上进行实验，结果表明IL一8shRNA2质粒表达载体转粢后口丁明显抑制癌细胞的增值、趋化作用，与对照组相比具有显著差异(P

6、5)。结论：IL一8shRNA真核表达载体Ⅱr以特异、高效地抑制富颈癌CaSki细胞株IL．8基【月和蛋白的表达，并且可以降低CaSki细胞的兜降形戍率，抑制其增螭和趋化运动能力，有望成为宫颈癌基因治疗的合理策略之一。关键词：RNAi，白细胞介素8，宫颈癌，基因治疗¨山西医科大学硕0学位沦空InhibitoryEffectsofRNAInterferenceontheExpressionofIL一8OncogeneinCervicalCancerCellLineCaSkiABSTRACTCarcinomaoftheuterinecervixthatwea咒usu

7、allytoseeisthesecondcommonestfemalecaueerintheworld．Theprevalenceliesinfirstplaceinourcountryandbecomeoneofthemaindiseasewhichseverelythreatenhealthofwomeninourcountry．ExpressionoftheCXCehemokine，interleukin-8{IL一8)，inmanycancercellshasbeenshowntocorfelmewiththeangiogenesis，tumofigem

8、city,andmeta