小干扰RNA表达载体抑制子宫颈癌HPV16+E7基因的研究

《小干扰RNA表达载体抑制子宫颈癌HPV16+E7基因的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、声明Y792900本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。2005．5}‘a■￡一爵即7}乡人师申导四川大学临床医学博士学位论文小干扰RNA表达载

2、体抑制子宫颈癌HPVl6E7基因的研究导师：彭芝兰教授研究生：王丹青中文摘要背景与研究目的高危型HPV感染在宫颈癌的发生发展中起着至关重要的作用，特别是E6／E7癌基因，已被证实有恶性转化能力，因此它们已成为宫颈癌基因治疗的理想靶点。RNA干扰(RNAincerference，RNAi)是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法，它比反义寡核苷酸和核酶技术能更高效的抑制目的基凶的表达。已有研究证实化学合成的siRNA(smallinterferingRNA)能高效地介导RNAi作用，但作用持续时间短，

3、而采用siRNA表达载体(smallinterferingRNAexpressiOilvector)的方法可能延长作用时间。因此本研究旨在探讨HPVl6E7特异性SfRNA表达载体对宫颈癌Caski和SiHa细胞E7基因的沉默作用及作用持续时间，以及体内外对肿瘤细胞生长的影响，探索siRNA表达载体作为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。方法1．利用计算机辅助设计软件，设计合成了含不同HPVl6E7特异性序列的56m寡核苷酸片段，并将其定向克隆入真核表达载体psiRNA，得到重组质粒P1、P2、P3；2．利

4、用脂质体将重组质粒转染CaSki和SiHa细胞，以荧光定量RT，PCR检测不同时间点转染前后E7mRNA的变化，以免疫荧光标记法、westernblot检测转染前后E7蛋四川大学临床医学博士学位论文白的变化；3．以流式细胞仪、MTT检测重组质粒P1和空质粒PO转染CaSki和SiHa细胞后细胞周期及细胞增殖的变化；4．将重组质粒P1转染CaSki细胞后，接种到裸鼠皮下，观察体内致瘤活性及生长情况；免疫组化检测瘤体HPVl6E7蛋白的表达。结果1．利用PCR分析，DNA测序证实HPVl6E7特异性siR

5、NA表达载体P1、P2、P3已成功构建。2．重组质粒P1、P2、P3转染CaSki细胞，抗性克隆形成后1周，它们对E7mRNA抑制率分别为92．86％，54．24％，87．22％：对E7蛋白的抑制率分别为84．2l％，44．66％，83．46％。重组质粒P1对CaSkJ细胞E7基因的抑制作用更有效。3．重组质粒P1、P2、P3转染SiHa细胞，抗性克隆形成后l周，它们对E7mRNA抑制率分别为92．15％，54．51％，87．22％；对E7蛋白的抑制率分别为84．30％，41．65％，82．91％。重

6、组质粒P1对SiHa细胞E7基因的抑制作用更有效。4．重组质粒P1转染CaSki和SiHa细胞抗性克隆形成后4周，对E7mRNA抑制率分别为68．95％、65．69％，对E7蛋白的抑制率分别为62．50％、59．11％。5．重组质粒P1转染CaSki和SiHa细胞抗性克隆形成后l周，与未转染组相比，Gl期细胞比例明显增多，S期细胞比例明显降低。重组质粒P1体外能抑制CaSki和SiHa细胞的增殖。6．重组质粒P1使宫颈癌CaSki细胞裸鼠体内成瘤时间延长，细胞生长减慢，瘤体体积及重量明显小于或轻于Ca

7、Ski组及CP0组，抑瘤率为50．61％。重组质粒P1在体内能抑制CaSki细胞E7蛋白的表达，抑制率为74．75％。四JIl大学临床医学博土学位论文结论HPVl6E7siRNA表达载体能特异、高效地抑制宫颈癌CaSki和SiHa细胞E7基因的表达，作用时间至少可维持抗性克隆形成后4周，并可调控肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞的恶性增殖，部分逆转其恶性表型，有望成为宫颈癌基因治疗的合理策略之一。【关键词】宫颈癌HPVl6E7RNAi基因治疗siRNA表达载体——些型奎堂堕堕垦兰堡圭兰垡堡苎Inhibitio

8、nofHPVI6E7OncogeneinCervicalCancerbyE7-SpecificsiRNAExpressionVectorZk肋7PostgraduatePengZhilanWangDanqingABSTRACTBackground＆ObjectiveHi曲一riskhumanpapillomavirus(HPV)infectionisbelievedtoplayacentralinthecarcinogenesisanddevelopme