rna干扰靶向抑制胃癌sgc7901细胞cox2基因和蛋白表达的研究

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1、RNA干扰靶向抑制胃癌SGC7901细胞COX2基因和蛋白表达的研究【摘要】目的利用RNAi技术，以胃癌SGC7901细胞COX2作为靶点，建立有效的RNA干扰方法，为胃癌及其复发和转移提供基因治疗的新方法。方法设计并合成6条COX2siRNA和1条阴性对照siRNA，用3种不同的转染试剂分别转染胃癌SGC7901细胞，荧光定量PCR和ethodsSixpiecesofCOX2smallinterferenceRNA(siRNA)andonenegativecontrolsiRNAicall

2、y,gastriccancercelllineSGC7901mediatedbythreedifferenttransfectionreagent.COX2mRNAandCOX2proteinofgastriccancercelllineSGC7901equantitativePCRandEM稀释至50μl，在室温下放置5min，0.8μg的pcDNA/lacZ、siRNA或DNA/siRNA用optiMEM稀释至50μl，将上述稀释液混匀，在室温下放置30min；加入培养基中，振板摇匀。2

3、4～72h后检测基因表达情况。1.2.4荧光定量PCRCOX2上游引物5’GAATCATTCACCAGGCAAATTG3’，COX2下游引物5’TCTGTACTGCGGGTGGAACA3’，COX2探针5’FAMTGGCAGGGTTGCTGGTGGTAGGATAMRA3’。将SGC7901细胞中克隆的COX2基因克隆到pMD18TVector上，在大肠杆菌中扩增，提取重组的pMD18TCOX2质粒，经岛津分光光度计检测，确定含有COX2基因的重组质粒的浓度，并确

4、定每微升DNA溶液中的拷贝数，做为标准品。使用RealTimeRTPCR试剂盒，RT反应体系为：MgCl22μl、10×RT缓冲液1μl、dNTP(各10mM)1μl、RNaseinhibitor0.25μl、AMVReverseTranscriptase0.5μl、RandomPrimer0.5μl、RNA模板1μg、补水至10μl。RT反应条件：30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。PCR反应体系2×RealTimeRTPCRMix12.5μl，上述RT反应产物

5、10μl，补水至25μl。PCR条件：94℃3min，94℃30s，57℃30s，72℃45s,40个循环。使用自动PCR仪检测。1.2.5arker（1∶1000）。结果用凝胶图像成像及化学发光系统分析，测定信号条带的吸光度值。将已发光的膜洗脱后，重新孵育另一个抗体（兔源性GAPDHⅠ抗1∶500）作内参照，步骤同上。最后用目的蛋白值/内参照蛋白值的比值作为该蛋白的相对含量。2结果2.1转染方法的建立用三种转染试剂分别以报告基因pcDNA3.1/His/lacZ转染胃癌SGC7901细胞，结果发

6、现：TOPeasy不能够有效介导DNA（pcDNA/lacZ）转染SGC7901细胞（图1）；lipofectamin2000可以介导DNA（pcDNA/lacZ）转染SGC7901细胞，但作用微弱（图2），细胞转染率为10.2%；TOPtranfection能够有效介导DNA（pcDNA/lacZ）转染SGC7901细胞（图3），细胞转染率为56.0%；lipofectamin2000可以介导DNA（pcDNA/lacZ）和siRNA转染SGC7901细胞，但抑制效果不明显（图4）；TOPtra

7、nsfection能够有效介导DNA（pcDNA/lacZ）和siRNA共转染SCG7901细胞，并敲低lacZ基因的表达（图5）。2.2荧光定量PCR在24孔板上接种SGC7901细胞，在次日细胞密度达到70%～80%。TOPtranfection2.0μl用optiMEM稀释至50μl，在室温下放置5min；COX2siRNA(0～5号）及阴性对照siRNA各0.4μg分别用optiMEM稀释至50μl；将上述两种稀释液混匀，在室温下放置30min；加入培养基中，振板摇匀。24h后检测C

8、OX2基因表达情况，结果见表2。表2siRNA转染后COX2mRNA拷贝数　　2.3COX2蛋白表达情况收集经COX20siRNA及阴性对照siRNA转染的胃癌细胞1×107，用BCR/ABL融合基因特异的siRNA转染K562细胞,发现K562细胞中相应的mRNA被清除,并出现强烈的细胞凋亡现象。Ning等［8］发现抗凋亡蛋白survivin对癌细胞有上调作用,并且可能有防止膀胱癌细胞凋亡的作用,他们通过siRNA介导的survivin阻滞,使得癌细胞的存活能力下降,并