靶向bcl--2基因的microrna直核表达质粒的构建及其转染效率鉴定

《靶向bcl--2基因的microrna直核表达质粒的构建及其转染效率鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、温州医学院硕士学位论文靶向Bcl--2基因的microRNA直核表达质粒的构建及其转染效率鉴定姓名：方潇碧申请学位级别：硕士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：廖志苏2012-05-06温州医学院硕士学位沦文靶向Bcl．2基因的microRNA真核表达质粒的构建及其转染效率鉴定中文摘要目的1．构建针对人鼻咽癌CNE．2Z细胞Bcl．2基因microRNA真核表达载体pENTR．CMV-EGFP．hsa．mir．16．1／15a。2．将重组质粒pENTR—CMV-EGFP．hsa—mir一16．1／15a转染至CNE

2、．2Z细胞并检测其转染效率。方法1．设计、合成引物参照hsa．mir．16．1／15a基因序列(GenbankGeneID：262205626／262205622)的编码区，利用引物设计软件PremierPrimer5．0进行设计。上游引物：5一AAcAAGATTATCAATAATAcTGAA．3，同hsa．mir．16．1／15aN端序列一致，并引入XhoI酶切位点；下游引物：5．CACCTCGAGTGCTGGGCACAGAATG．3，为hsa．mir．16．1／15aC端的互补序列，并引人EcoRI酶切

3、位点。引物由上海生工合成。2．目的基因cDNA的获取以pGH．16．1／15a．X2370G为模板，常规PCR扩增hsa．mir-16．1／15a的基因序列。PCR产物经1．0％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片段。3．酶切用XhoI和EcoRI双酶切pGH．16．1／15a．X2370G质粒及pENTR—CMV-EGFP空载体。分别回收质粒pENTR-CMV-EGFPXhoI+EcoRI大片段和质粒pGH．16．1／15a．X2370GXhoI+EcoRI小片段(约612bp)。4．连接将上步所得的质粒pE

4、NTR-CMV-EGFPXhoI+EcoRI大片段和质粒pGH．15a．X2370GXhoI+EcoRI小片段连用T4DNALigase连接酶接起来，得到pENTR．CMV-EGFP．hsa．mill6．1／15a重组质粒。5．pENTR．CMV-EGFP．hsa．mir．16．1／15a重组质粒的转化过夜连接产物转化感受态细胞DH5a，菌液分别涂布于含Kanar抗性(终浓度为30ug／m1)的LB平板上，37。C恒温培养箱培养过夜。次日从每个培养皿上挑取单克隆菌落接种于3ml含Kanar抗性(终浓度为30

5、ug／m1)的LB培养液中，37。C恒温摇床培养8h。6．质粒DNA的提取及鉴定2温州医学院硕士学位论文结果结论用试剂盒小量提取重组质粒pENTR．CMV-EGFP．hsa．mir-16-l／15a，用PCR做鉴定并测序。7．重组质粒转染CNE．2Z细胞用脂质体Lipofectamine2000分别介导空质粒(pGenesil-1．1)及重组质粒(pENTR．CMV-EGFP．hsa．mir．16．1／15a1转染细胞，并设空白未转染组作对照。8．荧光显微镜观察转染后的CNE．2Z细胞分别于24h、48h、

6、72h后置于荧光焦显微镜下观察细胞形态，并计算转染效率。1．构建成的重组质粒称之为pENTR．CMV-EGFP．hsa．mir．16．1／15a，经酶切与测序证实构建成功，无任何碱基突变。2．重组质粒转染至鼻咽癌CNE．2Z细胞后，荧光显微镜下可观察到绿色荧光，证实该重组质粒转染成功。3．转染后24h对照组与实验组转染效率分别为：(15+1．6)％，(15+1．7)％，转染后48h对照组与实验组转染效率分别为：(37土1．3)％，(38土0．8)％，转染后72h对照组与实验组转染效率分别为：(24士3．9)

7、％，(25士4．2)％。成功构建针对人类鼻咽癌细胞CNE．2ZBcl．2基因的microRNA真核表达质粒pENTR．CMV-EGFP．hsa．mill6．1／15a，并在鼻咽癌CNE一2Z细胞中转染成功。在转染效率方面，对照组与实验组均于转染后48h时最高，在细胞形态方面，转染48h时细胞生长状态佳。因此转染效率在48h最显著。故下一步实验研究应在转染48h时进行，可得出更合理，更令人信服的数据。成功构建的microRNA真核表达质粒pENTR-CMV-EGFP—hsa-mir-16-1／15a可用于进一

8、步检测其抗肿瘤机制，在基因水平诊断及治疗鼻咽癌。【关键词】16．1／15a．X2370G；重组质粒；CNE．2Z；构建；转染温州I医学院硕士学位论文ConstructionoftargetingBcl·-2microRNAeukaryoticexpressionplasmidanditsidentificationoftransfectionefficiencyAbstractObjective1．Toconst