fasl基因rna干扰质粒的构建与鉴定

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1、FasL基因RNA干扰质粒的构建与鉴定龚青1,2徐进文3（通讯作者）徐祖敏2高国全2（1广州医学院基础学院生化教研室510180）（2中山大学中山医学院生化教研室510080）（3广州中医药大学基础学院生理教研室510080）【摘要】目的构建细胞凋亡受体通路相关蛋白FasL表达的RNA干扰（RNAi）质粒，为研究FasL参与的细胞信号通路提供稳定转染细胞的RNA干扰质粒。方法选取FasL基因的19nt特异性序列，设计针对FasL的shRNA序列，应用基因重组技术克隆到pSilencer1.0-U6表达载体中,EcoRI和ApaI进行双酶切和DN

2、A测序鉴定重组克隆，在脂质体的介导下含FasL基因RNAi的重组载体转染脐静脉血管内皮细胞，转炎48h后，收集细胞裂解液，Westernblotting分析对照组与转染组FasL蛋白的表达水平。结果双酶切证实shRNA正确插入pSilencer1.0-U6质粒,DNA测序证实插入的序列正确；FasL基因RNAi的载体转染血管内皮细胞成功;Westernblotting结果显示与空质粒对照组比转炎组细胞FasL表达下调。结论成功构建人FasL基因RNA质粒，为研究FasL参与的细胞信号通路提供了稳定的转染细胞载体。【关键词】载体FasLRNAi胞

3、外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内。死亡通路在免疫系统发育和功能中起重要作用，FasL参与许多细胞因子和药物对细胞的调控作用，是许多抗肿瘤药物的作用机制。RNA干扰（RNAi）是双链RNA介导的特异性基因沉默现象，是目前研究基因功能强有力的工具之一［1］。木研究以siRNA介导FasL表达沉默，采用脂质体作为转染试剂，观察siRNA导入后对人内皮细胞株HUVEC内的FasL表达的抑制作用,为研究FasL参与的细胞信号通路提供了稳定的转染细胞干扰质粒。1材料和方法1.1材料：载体质粒为pSilencer1.0-U6;大肠杆菌DH25α

4、为木实验室保存；限制性内切酶EcoRI和Apal,T4DNA连接酶购自美国Invitrogen公司;DNA胶回收试剂盒购自美国Qiagen公司；lKbLadder购自广州东盛生物科技有限公司;1640、脂质体Lipofectamine2000、Gibco胎牛血清购自Invitrogen公司;质粒抽提试剂盒为NucleoBondXtraMiDiEF（美国）。1.2方法1载体的构建和鉴定：pSilencer1.0-U6Vector为RNA干扰专用载体。按照siRNA靶序列设计原则，选取基因mRNA序列特异的19个寡核苷酸作为siRNA干扰区域,自行

5、设il•一对针对FasL的shRNA互补序列，插入pSilencer1.0-U6。本研宄构建了FasL干扰序列如下：1.Fas-L–BS/U6-Al：5'-CGGAAGACACCTATGGAATTTTCAAGAGAAATTCCATAGGTGTCTTCCTTTTTTG-3'2.Fas-L–BS/U6-A2:5'AATTCAAAAAAGGAAGACACCTATGGAATTTCTCTTGAAAATTCCATAGGTGTCTTCCGGGCC-3'3.Fas-L–BS/U6-Bl：5'-CGCAGAACTCCGAGAG

6、TCTATTCAAGAGATAGACTCTCGGAGTTCTGCTTTTnG-3'4.Fas-L–BS/U6-B2：5'-AATTCAAAAAAGCAGAACTCCGAGAGTCTATCTCTTGAATAGACTCTCGGAGTTCTGCGGGCC-3'RNA干扰质粒的构建及提取利用分子克隆的方法将S的序列退火连接入载体，获得siRNA重组质粒，转化感受态细胞获得重组菌，挑选阳性克隆，培养并制备质粒，用EcoRI和Apal双酶切鉴定。酶切鉴定正确的克隆送公司测序证实。2重组菌大规模扩增后用去内毒素的质粒DNA制备试剂盒(Nucleo

7、BondXtraMiDiEF)按说明书步骤提取质粒,-80°C保存。3HUVEC的原代选择性培养人脐静脉血管内皮细胞的获取与培养：按文献报道方法获取脐静脉内皮细胞［2】，在铺了2%的明胶的塑料培养瓶中培养，加入含冇15%血清的内皮细胞专用培养液，置于37°C,5%C02静止培养24h后更换培养液，除去未贴壁的细胞。每隔2d换液1次，以维持细胞的营养和内环境稳定。4RNA干扰质粒转染细胞采用脂质体试剂Lipofectamine2000进行培养细胞转染(参考invitrogen的说明书)，质粒DNA(μg)与脂质体Lipofe

8、ctamine2000(μl)的比例为1:2.5。转染细胞6h后，吸出无血清培养液，换成含10%FBS的培养液过夜，在特定的吋间点进行相应检测。