大鼠蛋白精氨酸甲基转移酶1短发夹rna质粒的构建、鉴定与体外rna干扰

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1、山西医科大学硕士学位论文大鼠蛋白精氨酸甲基转移酶1短发夹RNA质粒的构建、鉴定及体外I州A干扰捅要一、编码大鼠PRMTl基因shRNA质粒的构建和鉴定目的：为研究蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMTl)基因表达的改变与血管内皮功能及动脉粥样硬化的关系，我们构建了PRMTl短发夹RNA质粒(pPRMTl．shRNA)。方法：在OenBank中查到大鼠PRMTl基因mRNA序列并输入siRNA网上设计软件OptiRNA中，选取两条靶序列，设计并合成编码shRNA序列的DNA单链，经退火连接后，与双酶切线性化处理回收的pGenesil．1

2、质粒载体连接，用含卡那霉素抗性的LB平板筛选阳性克隆，小提质粒后行酶切鉴定并测序。结果：构建的大鼠pPRMTl．shRNA经酶切鉴定及测序与预期相符。结论：本研究结果为进一步进行体外基因干扰PRMTl研究奠定了基础。二、PRMTl．shRNA质粒转染大鼠主动脉内皮细胞条件的优化目的：优化pPRMTl．shRNA在聚乙烯亚胺转染剂jetPEITM．RGD介导下转染原代培养大鼠主动脉内皮细胞的转染条件。方法：贴块法原代培养大鼠主动脉内皮细胞，经免疫细胞化学法(S．P法)鉴定，取3～4代细胞，按不同jetPEITM．RGD／pPRMT

3、l．shRNA比例进行转染，24小时后测定各组转染效率及细胞存活率。结果：6孔培养板每孔加入3．099的pPRMTI-shRNA并以N／P=5加入jetPEITM．RGD转染效率最高，为53．54％。结论：本研究为高效地进行细胞转染及进一步研究基因干扰PRMTl基因对血浆同型半胱氨酸(Hcy)、非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平和血管内皮功能的影响奠定了基础。三、PRMTl．shRNA质粒对大鼠主动脉内皮细胞PRMTl表达的影响目的：探讨pPRMTl．shRNA在体外对大鼠主动脉内皮细胞PRMTl基因mRNA表达水平的影响。方

4、法：用pPRMTl．shRNAl、pPRMTl．SⅪ峭A2阳性质粒、阴性对照pHK质粒转染大鼠主动脉内皮细胞，同时设立空白对照组。转染12、24小时后分别收集各组细胞，提取细胞总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统分析各组PRMTl基因的mRNA表达情况。结果：pPRMTl．shIⅢAl及pPRMTl．shRNA2转染组12、24小时PRMTl基因mRNA表达较阴性对照pHK及空白对照组均明显降低(P

5、PRMTI基因mRNA表达受抑较12小时显著(P

6、医科大学硕士学位论文Abstract，PartIConstructionandidentificationofplasmidpGenesil一1一shRNAexpressingtheratproteinargininemethyitransferase1Objective：ToconstructtheexpressionplasmidsofshorthairpinRNA(shRNA)targetedtotheratproteinargininemethyltransferasesI(PRMTl)geneforfurtherinv

7、estigatingtherelationshipbetweentheexpressionofPRMTlgeneandthefunctionofvascularendothelium．Methods：ThesequenceofratPRMTlmRNAwasfoundintheGenBankandcopiedtothedesignsoftwareatnet．Twotargetsequenceswereselected．SinglestrandsofencodingshRNAweredesigned，synthesizedandco

8、njunctedbyannealing，afterwhichtheannealedduplexeswereconjugatedwitllplasmidvectorspGenesil一1thatwereonlinearizationthroughdigested、