Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定

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1、Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定【摘要】目的：构建Cdhl小干扰RNA载体，并将其转染至Held细胞进行鉴定.方法：根据pENTRTM/Hl/T0中间载体要求，设计Cdhl小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列，合成相应的DNA单链，退火后连接到pENTRTM/111/TO线性载体，形成完整载体，进行测序鉴定.分别将测序鉴定成功的Cdhl小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染Hela细胞，转染后48h提取细胞总RNA及细胞总蛋白，采用实时定量PCR和WesternBlot检测Cdhl的表达.结果

2、：经测序鉴定成功构建Cdhl小干扰RNA载体和对照载体，分别命名为pENTR/shCdhl和pENTR/shcontrol.与未转染及转染pENTR/shcontrol的Ilela细胞相比，转染pENTR/shCdhl的Hela细胞Cdhl表达降低(P<0.05)・结论：成功构建Cdhl小干扰RNA载体，并能下调Hela细胞Cdhl的表达.【关键词】细胞周期细胞分裂RNA小干扰Hela细胞0引言Cdhl是细胞周期后期分裂促进复合物(anaphasepromotingcomplex,APC)的一个调节亚基，在

3、细胞周期调控中发挥着重要作用.近年来研究发现，CdhlAPC在哺乳动物神经元屮有大量表达，具冇调节轴突生长和突触形成的功能，其在中枢神经系统疾病的发生发展中起重耍作用[1]・为了进一步探讨Cdhl的功能，我们拟构建Cdhl小干扰RNA载体，并将其转染至Ilela细胞进行鉴定.1材料和方法1.1材料pENTRTM/Hl/TO载体试剂盒、TOP10感受态细菌和脂质体Lipofectamine2000均购自Invitrogen公司（美国）；DMEM/F12培养基、小牛血清购自Gibco公司（美国）；实时定量PCR试剂盒

4、购自Takara公司（H本）；LightCycler实时荧光定量PCR仪为Roche公司（美国）.1.2方法1.2.1载体的构建根据pENTRTM/Hl/TO载体要求和参考文献［2］设计Cdhl小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列，合成相应的DNA单链，具体设计如下：丁扰序列topstrand5'CACCAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGCGAACTGACTGGGAGACTTCTCA3’,bottomstrand5’AAAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGTTCGCTGACTGGGAGA

5、CTTCTCATT3’;对照序列topstrand5'CACCAAGAATGTCATCTACCACGGGCGAACCCGTGGTAGATGACATTC3',bottomstrand5'AAAAGAATGTCATCTACCACGGGTTCGCCCGTGGTAGATGACATTCTT3'・将干扰序列和对照序列根据退火条件95°C退火4min,室温自然冷却5~10min得到退火产物，用T4DNA连接酶连接到pENTRTM/Hl/TO线性载体上，16°C连接2h,连接产物转化T0P10感受态细菌，平铺入含卡那霉素（50m

6、g/L）抗性平板中过夜培养，挑取单菌落扩增培养.提収质粒后，由英骏生物技术有限公司进行DNA测序鉴定.质粒分别命名为pENTR/shcdhl和pENTR/shcontrol.1.2.2细胞转染采用脂质体转染法将pENTR/shcdhl和pENTR/shcontrol质粒分别转染Hela细胞，转染前1d将Hela细胞传代至六孔板，密度为90%左右，在2个Eppendorf管中均加入250ULOPTTMEMI培养基，然后分别加入10uL脂质体和4Pg质粒混匀，室温下孵育5min.轻柔混合两管液体，37°C孵育20mi

7、n,加入Ileb细胞中，将细胞置于37°C,50mL/LC02培养箱中转染4h后换成含有100mL/L小牛血清的DMEM/F12培养基.转染后48h,提取细胞总mRNA,逆转录成cDNA.1.2.3实时定量PCR检测Cdhl的表达以逆转录产物为模板进行实时定量PCR反应，以Bactin基因为内参照，94°C变性5s,60°C退火及延伸20s,共反应40个循环，分析融解曲线・Cdhl基因上游引物为5’GCCAACTGGAGCGTGAACTT3’，下游引物为5’TTCAGCAGTGCGGAGTAGGC3’・3acti

8、n基因上游引物为5'TGACAGGATGCAGAAGGAGA3',下游引物为5'TAGAGCCACCAATCCACACA3’・以ACt表示Cdhl的表达,ACt=Ct(Cdhl)-Ct(Pactin),ACt值越高，Cdhl的表达越低[3].1.2.IWesternBlot检测Cdhl的表达分别提取转pENTR/shcdhl,pENTR/shcontrol及未转染的Hel